组织学技术培训班讲义 第一部分 基础准备工作 一、玻片清洁 新玻片:自来水冲洗或洗衣粉擦洗,清洁液浸泡1天以上,清水冲洗干净,95%酒精浸泡数小时或过夜,用干净的棉布擦干,置干燥箱或37~60℃温箱烤干 旧玻片(带盖玻片的载玻片):酒精灯上加热除去盖片或放大量废二甲苯浸泡7天左右,盖片与载玻片分离,入肥皂水煮沸,自来水冲洗,清洁液浸泡1天以上,清水冲洗干净,95%酒精浸泡数小时或过夜,用干净的棉布擦干,置干燥箱或37~60℃温箱烤干。重染标本则经各级酒精下行至水,重新染色 玻璃器皿清洗:包括量杯、量筒、烧杯、磨口瓶、细口瓶、广口瓶、三角烧瓶、容量瓶等 二、常用试剂配制 1 蛋白甘油:用眼科镊或拨针在新鲜鸡蛋尖端挑破一小孔,在另一端再挑一小孔并稍捅大,大端向下,蛋白流入烧杯,不要蛋黄。用玻棒将蛋白打成泡沫,倒入垫有几层纱布的漏斗过滤,得到清澈透明的液体。加等量甘油(Glycerine),摇匀,加麝香草酚(Thymol)或樟脑(camphor)(约1%)防腐。 2 多 聚赖氨酸:取多聚赖氨酸( Poly-L-Lysine,PLL)10毫升加蒸馏水90毫升,置冰箱保存 3 生理盐水: 氯化钠(Sodium chloride)0.85或0.9克溶于蒸馏水100毫升(哺乳类温血动物)氯化钠0.64克溶于蒸馏水100毫升(两栖类) 氯化钠0.75克溶于蒸馏水100毫升(鸟类) 氯化钠1.5~2.6克溶于蒸馏水100毫升(海生动物) 4 卢戈氏(Lugol)碘液:蒸馏水100~200毫升,碘(Iodine)1克,碘化钾(Potassium iodide)2克 5 苯胺水:苯胺油(Aniline )5毫升,蒸馏水95毫升,充分振荡,混匀后过滤。静置24小时使用 6 盐酸酒精:70%酒精(Alcohol)100毫升,浓盐酸(Hydrochloric acid)0.5或1毫升 7 石炭酸二甲苯(1:3~4):石炭酸(Carbolic acid)10克与二甲苯(Dimethylbenzene)30或40毫升混合 8 碳酸锂饱和水溶液:蒸馏水100毫升加入碳酸锂(Lithium carbonate)至饱和(1.3%) 9 碘酒:碘5克,95%酒精80毫升,蒸馏水20毫升 10 5%硫代硫酸钠水溶液:硫代硫酸钠(Sodium hyposulfite)5克,蒸馏水100毫升 11 梯度酒精:单位:毫升 10% 15% 20% 30% 35% 50% 60% 70% 75% 80% 90% 95% 95%酒精 10.5 15.7 21.0 31.5 36.8 52.6 63.1 73.6 79.0 84.2 94.5 100 蒸馏水 89.5 84.3 79.0 68.5 63.2 47.4 36.9 26.4 21.0 15.8 5.5 0 第二部分 石蜡切片制作过程 一、材料选取与取材 主要是人的材料,来源于手术活检、尸检等 实验动物:来源广,容易获取,部分能代替人的正常组织;实验动物建模 常用实验动物有:大小鼠、豚鼠、兔、猫、狗等 1 选取合适的实验动物: 肥大细胞:大、小鼠皮下组织及肠系膜、大网膜铺片;大鼠肠系膜肥大细胞颗粒不溶于水 胰岛细胞:豚鼠胰腺尾部 内耳(螺旋器):豚鼠内耳 运动终板:小鼠肋间肌 卵巢:猫卵巢可见各级卵泡 嗅黏膜:狗(比人发达) 环层小体:猫(肠系膜和足掌最多) 叶状乳头:兔(最典型) 结缔组织铺片:小鼠、大鼠 淋巴结:猫淋巴结(肠系膜) 脾:狗脾 2 根据实验要求选择动物致死方法 肠系膜铺片:股动脉放血法 下丘脑神经内分泌物:不宜用乙醚麻醉 血管注射标本:不宜空气栓塞法 3 致死方法主要有: ⑴麻醉法+股动物放血法: 浸有乙醚(Diethyl ether)/氯仿(Chloroform)棉球连同动物放入密闭容器内麻醉 4%戊巴比妥(Pentobarbital)静脉注射(1毫升/公斤体重) 20%氨基甲酸乙酯(尿烷、乌拉坦、乌来糖Urethane )腹腔注射(5毫升/公斤体重) 动物麻醉后切开股动脉放血 ⑵空气栓塞法: 兔耳静脉经50毫升注射器注入空气 ⑶击头法: 大、小鼠用重物猛击其头部或将其头后部猛撞桌沿,一击而死 ⑷断头法: 用剪刀剪去青蛙、小鼠等小动物头部 用斧头砍死较大动物 ⑸颈动脉放血法: 较大动物用尖刀插入颈动脉,使其血液流出 4 熟悉动物部位组织结构特点: 胰岛:胰腺尾部 脊髓神经元:脊髓颈、腰膨大处 肺:细支气管及带有软骨片的小支气管部位 胃:胃底部(胃底腺主细胞、壁细胞、颈黏液细胞、内分泌细胞) 5 组织切面选择: 横切:管状器官,如气管、支气管、食管、输尿管、输卵管、输精管、胃、肠、阑尾 纵切:肠绒毛 冠状切:脑垂体 保持组织原有形态 神经(如坐骨神经)、肌组织等:将两端用线扎住固定 6 其它 组织块厚度:1.5×1.5×0.2~1.0cm(科研0.2~0.5cm,教学0.5~1.0cm);熟悉解剖部位;保持材料新鲜 在动物心跳停止时30分钟内完成取材 刀剪锋利,不可来回挫动组织 保持组织清洁:用生理盐水冲洗血液、粪便、黏液、食物、污物等 二、固定 (一)根据组织形态结构选择合适的固定液 一般组织:10%甲醛(Formaldehyde),包括甲醛生理盐水、缓冲甲醛液);Bouin液;4%多聚甲醛(Polyoxymethylene) 胰岛细胞:Helly液 脑垂体腺细胞:Zenker液 几丁质(壳多糖,甲壳胺Chitin):硝酸(Nitric acid),Gilson液 含钙质组织(骨、牙、齿):硝酸、三氯醋酸(Trichloroacetic acid) 肥大细胞:甲醛酒精液、甲醛酒精醋酸液、Zenker液、Susa液 成纤维细胞(fibroblast):甲醛酒精醋酸液、Zenker液 脂肪细胞(Adipocyte):Flemming液,2%锇酸(锇酸)水溶液;重铬酸钾(potassium dichromate) 巨噬细胞(macrophage cell)或浆细胞(Plasma cell):10%甲醛液,Zenker液 染色质(chromatin)或染色体(chromosome):醋酸;含汞固定液如Susa液和Romeis液 皮肤(skin):苦味酸(Picric acid) 蛋白质(protein):甲醛、酒精、升汞(Mercury dichloride) 糖原(glycogen):50%以上酒精,Carnoy液 碳水化合物(carbohydrate):苦味酸酒精液 高尔基复合体(Golgi complex):重铬酸钾;锇酸;Regaud液,Helly液,Altmann液,Champy液,Flemming液 核蛋白(nucleoprotein ):铬酸(Chromic acid) 胚胎(embryo ):苦味酸硫酸(Sulfuric acid)液 Mallory三色染色法:Zenker、Helly、Bouin液;甲醛液+切片Zenker或Bouin液媒染 Masson三色染色法:甲醛升汞液,Bouin液或Zenker液;单纯甲醛液+切片3%升汞或苦味酸酒精液 醛品红染色法:10%甲醛液,甲醛酒精液,Bouin液 地衣红染色:10%甲醛液,甲醛酒精液,Helly液 天青Ⅱ伊红(Azure II Eosin)染色法:10%甲醛,Zenker液 (三)根据结构要求选择固定方法 细小而薄的标本如血液、骨髓涂片及某些薄膜组织:(锇酸或甲醛)蒸汽固定;直接用甲醇(Methanol)或95%酒精或无水酒精(Absolute alcohol)固定 肺:从气管或支气管注入固定液。用力均匀,注射量适当 眼球:从眼后房注入固定液 肝:从肝动脉注入固定液;切断肝静脉。 肾:从肾动脉注入固定液,切断肾静脉 脑:动物麻醉后,暴露颈动脉,用注射针头尖向头部方向注入固定液,液体出口开在颈静脉或左心房上 注入固定液前,用生理盐水冲洗至无血色为止 兔、猫、狗、猴及整个人体:从一侧颈总动脉或股动脉注入固定液,另一侧切开静脉放血(兔、猫500~1000毫升;猴、狗1000~2000毫升) 大、小鼠:吸入乙醚深度麻醉,打开胸腔,纵向切开心包膜,用纱线在动脉弓打一松结,用50毫升注射器选用适当针头,从左心室向主动脉方向刺入,针尖刺入后,用手将纱线扎住央右心房开一孔放血。先用动物体温相当的生理盐水(Stroke-physiological saline solution)慢慢注入血管洗涤,流出的血液无血色,再注入固定液,至固定液充满全身。然后将整个器官放入固定液固定 人体或动物小块组织:立即放入固定液固定 软组织或较大组织:先固定2~3小时,修成小块再固定 (四)固定液 1 单纯固定液 ⑴10%甲醛水溶液:甲醛100毫升,自来水900毫升 ⑵10%甲醛生理盐水溶液:甲醛100毫升,自来水900毫升,氯化钠8.5克 ⑶10%缓冲甲醛溶液 ⑷4%多聚甲醛:多聚甲醛(Polyformaldehyde)40克,磷酸缓冲液1000毫升 ⑸5%三氯醋酸水溶液:三氯醋酸50克,蒸馏水1000毫升 ⑹80~95%酒精溶液 ⑺3~7%升汞水溶液:升汞30~70克,蒸馏水1000毫升 2 混合固定液 ⑴甲醛酒精溶液(AF或FA):95%或无水酒精90毫升,37~40%甲醛水溶液10毫升 固定数小时至12小时,90%酒精脱水 ⑵Schaffer甲醛酒精混合液 甲醛10毫升,80%或无水酒精20毫升 固定1~3天,经80%或95%酒精 、无水酒精脱水,二甲苯透明,石蜡包埋。 固定肥大细胞颗粒及黏液颗粒 ⑶甲醛酒精醋酸溶液(AFA、FAA液) 37~40%甲醛水溶液10毫升,95%酒精或无水酒精85~90毫升,冰醋酸5毫升 ⑷Schaffer甲醛酒精冰醋酸混合液 甲醛20毫升,95%酒精100毫升,用前加冰醋酸(Glacial acetic acid )2毫升 固定1~2天 ⑸Bouin液 苦味酸饱和水溶液75毫升,37~40%甲醛水溶液25毫升,冰醋酸5毫升 固定12~24小时,70~80%酒精洗涤至基本无黄色 ⑹Rossman液 苦味酸无水酒精饱和溶液(5.9%)90毫升,中性甲醛水溶液(40%)10毫升 室温固定12~24小时,95%酒精 洗几天;或冰箱内固定24小时,直接入无水酒精脱水几次。 ⑺苦味酸酒精溶液 80%酒精150毫升,甲醛水溶液60毫升,冰醋酸15毫升,苦味酸结晶1克 固定1天左右,直接入95%酒精 脱水 ⑻苦味酸硫酸液 蒸馏水洗100毫升,硫酸2毫升,加苦味酸至饱和 固定胚胎(鸡胚)2~4小时。 ⑼Verhoeff液 甲醛水溶液(40%)10毫升,95%酒精48毫升,蒸馏水36毫升,苦味酸1克 固定眼球48小时后脱水 ⑽甲醛醋酸钙(钠)升汞溶液 甲醛水溶液10毫升,醋酸钙(Calcium acetate)或醋酸钠2克,升汞6克,蒸馏水90毫升 固定胰腺,显示胰岛细胞 附:甲醛钙液,甲醛10毫升,蒸馏水90毫升,醋酸钙(Calcium acetate)1~2克 ⑾Zerker液 重铬酸钾2.5克,升汞5克,硫酸钠(Sodium sulfate)1克(可省),蒸馏水100毫升,冰醋酸5毫升 将重铬酸钾、升汞和蒸馏水混合,加温溶解,冷却后过滤,保存于棕色瓶(可用1~2年)。用时加冰醋酸。 细胞质和细胞核染色清晰,结果稳定 肌组织和结缔组织染色好 厚2毫米组织固定3~4小时;一般组织固定12~24小时。流水冲洗后至70%酒精 ,经碘酒脱汞,5%硫代硫酸钠(Sodium hyposulfite)去碘 ⑿Helly液(Zenker-Formol液) 重铬酸钾 2.5克,升汞5克,蒸馏水100毫升,甲醛水溶液(40%)(中性或略偏碱性)5毫升 固定细胞质 显示某些特殊颗粒:如胰岛细胞和脑垂体腺细胞 多用于骨髓、肝、脾、淋巴结和线粒体固定 ⒀Moximow液 重铬酸钾 2.5克,升汞5克,蒸馏水100毫升,甲醛水溶液(40%)(中性或略偏碱性)10毫升 ⒁Susa液 蒸馏水80毫升,升汞4.5克,氯化钠0.5克,三氯醋酸2克,甲醛水溶液(40%)20毫升,冰醋酸4毫升 将升汞、氯化钠和三氯醋酸溶于蒸馏水洗,转入棕色瓶保存。可贮存1~2年。用时加甲醛和冰醋酸。 固定1~24小时,直接入90%酒精脱水。 内耳等难于固定的组织固定 ⒂Romeis液 饱和升汞水溶液50毫升,5%三氯醋酸水溶液40毫升,用时加甲醛水溶液(40%)10毫升 一般组织固定12~24小时,小块组织固定1~2小时,直接入90%酒精脱水 有利于Heidenhain铁苏木精染色 ⒃Stieve液 饱和升汞水溶液76毫升,甲醛水溶液(40%)20毫升,冰醋酸4毫升 固定稍大块组织12~24小时,转入70%酒精脱水,碘酒精脱汞,5%硫代硫酸钠去碘 ⒄Gilson液 升汞20克,硝酸15毫升,冰醋酸4毫升,蒸馏水880毫升,60%酒精100毫升 小块组织固定30分钟,较大组织数小时 适于一般组织,特别是蛙卵的固定 ⒅Szent-Gyorgyri眼球固定液 丙酮(Acetone)125毫升,升汞4克,蒸馏水100毫升,甲醛液40毫升,冰醋酸5毫升 固定眼球2~5天 入甲醛20毫升,95%酒精100毫升,冰醋酸3毫升再固定1~2天 ⒆Worcester甲醛升汞液 将10%甲醛溶液加升汞至饱和 固定24小时,再用10%甲醛固定12~24小时 ⒇Regaud液 3%重铬酸钾水溶液80毫升,甲醛(中性)20毫升 固定后用3%重铬酸钾水溶液铬化4~7天 (21)Kolmer液 5%重铬酸钾水溶液20毫升,10%甲醛水溶液20毫升,冰醋酸5毫升,5%三氯醋酸水溶液5毫升,10%醋酸钠水溶液5毫升 固定眼球和神经组织 固定24小时 (22)Champy液 3%重铬酸钾水溶液7毫升,1%铬酸水溶液7毫升,2%锇酸水溶液4毫升 固定线粒体和类脂,组织很小 固定后流水冲洗24小时 (23)Müller液 重铬酸钾2克,硫酸钠1克,蒸馏水100毫升 固定数天,每天换新液。固定后流水冲洗24小时 (24)Orth液 重铬酸钾2.5克,蒸馏水100毫升,甲醛水溶液(40%)10毫升 固定时间:一般36~72小时 稍大的组织72小时,脑组织72小时 一般小组织24小时 固定后流水冲洗24小时 (25)AGFD固定液 丙酮(Acetone)50毫升,冰醋酸( Glacial acetic acid)2毫升,甲醛(Formaldehyde )液4毫升,蒸馏水(Ditilled water)3毫升 固定眼球一周,将原液倒出一半,加等量丙酮固定5天。直接转入95%酒精 脱水 (26)ADN固定液 无水酒精(Absolute aclohol)80毫升,蒸馏水(Ditilled water)16毫升,浓硝酸(Nitric acid)4毫升 固定1~2毫米心肌组织24小时,经碘酸钠苏木精块染显示闰盘 (27)Carnoy液 冰醋酸10毫升,氯仿30毫升,无水酒精60毫升 固定时间:小块组织2~3小时 固定后直接入无水酒精脱水 固定糖原和尼氏体 (28)Flemming液 1%铬酸水溶液15毫升,2%锇酸水溶液4毫升,冰醋酸1毫升 固定有丝分裂的细胞 适于铁苏木精染色 固定脂肪、髓鞘和线粒体 组织块小,厚度不超过2毫米 三、脱钙 (一)最佳脱钙液选择 硝酸甲醛液: 硝酸5毫升,甲醛5~10毫升,蒸馏水或70%酒精85~90毫升 改良Plank液 氯化铝(Aluminum trichloride)8克 盐酸(Hydrochloric acid)10毫升 甲酸(Formic acid)6.5毫升 蒸馏水100毫升 20~25℃脱钙2~3天,25~30℃1.5~2天 乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid,EDTA):白色粒状粉剂,溶于氢氧化钠(Sodium hydroxide)、碳酸钠(Sodium carbonate)和氨水(Ammonium hydroxide),微溶于沸水,不溶于醇和一般有机溶剂。脱钙用pH7.4~7,5,温度不超过30℃ EDTA 5.62克,加入蒸馏水100毫升。混合后加温煮沸,溶液呈混浊,再加14%氢氧化钠17.5毫升,溶液呈透明状,pH7.4。25℃脱钙需15天左右 (二)脱钙后处理 流水冲洗后用硫酸钠或碳酸锂水溶液中和,蒸馏水充分洗涤 (三)脱水透明浸蜡包埋等后续处理 正丁醇(1-Butanol)脱水兼透明 (四)切片展片 厚度8~15微米,展片温度45℃ (五)苏木精伊红染色 苏木精(Hematoxylin)深染,伊红(Eosin)淡染 (六)骨发生 1 骨的常用固定液: Zenker-甲醛液(骨髓),Helly液(指骨) 10%甲醛水溶液 80%酒精 Müller液:重铬酸钾2.5克,硫酸钠1克,蒸馏水100毫升 2 骨的脱水: 正丁醇脱水 70%酒精1小时 80%酒精 1小时 90%酒精1小时 无水酒精正丁醇等量混合液2小时 无水酒精丙酮1小时 正丁醇3小时 固定后脱钙 70%酒精1小时 80%酒精 1小时 90%酒精1小时 正丁醇4~6小时 直接入叔丁醇(tert-Butanol)3~5小时,直接浸蜡 环己酮(Cyclohexanone)3~5小时,直接浸蜡 二氧陆环(Dioxane)直接脱水:三氯醋酸脱钙,二氧陆环脱水2~3小时换2次 3 骨的透明: 苯(Benzene),香柏油(Cedar oil)(12小时以上),氯仿(24~72小时),苯甲酸甲酯(Methyl benzoate)(12~24小时),冬青油(Wintergreen oil)-苯甲酸甲酯(5:3) 4 骨的浸蜡 正丁醇脱水透明的骨组织 正丁醇50毫升+石蜡(Paraffin)50毫升,浸3小时,石蜡3小时 二氧陆环脱水透明的组织,二氧陆环50毫升+石蜡100毫升(56℃)3小时,石蜡(56℃)3小时 苯透明组织:苯50毫升+石蜡50毫升 2小时,浸蜡3小时 叔丁醇、氯仿、环己酮等透明,直接浸蜡延长1~2小时 5 脱钙骨染色 苏木精伊红染色法 松节油(Turpentine oil)脱蜡 无水酒精30秒 1%火棉胶(Collodion)液2秒,稍干 无水酒精30~60秒 各级酒精下行至水 1%硫酸钠水溶液3~5分钟(22~25℃) 流水冲洗5分钟 蒸馏水洗30~60秒 Carazzis苏木精(Carazzis's Haematoxylin)8~20分钟 Carazzis's Haematoxylin :苏木精3克,无水酒精5毫升(研磨),蒸馏水800毫升(加热),钾明矾(Aluminum potassium sulfate dodecahydrate)50克(95℃),碘酸钠(Sodium iodate)0.6克,甘油200毫升 用无水酒精研磨苏木精;热水溶解钾明矾。苏木精酒精溶液倒入钾明矾液,加入碘酸钠,流水冷却,加甘油,摇荡1小时,即可使用 盐酸分色5~10秒,流水冲至返蓝 0.5%复制伊红液1分钟 正丁醇无水酒精混合液( 3:2)脱水分色透明 树胶封固 苏木精-天青Ⅱ伊红染色法 试剂: 天青Ⅱ伊红水溶液(0.02%):天青Ⅱ伊红(Azure II Eosin)0.02克,蒸馏水100毫升 或:1%天青Ⅱ水溶液1毫升1%伊红水溶液1毫升蒸馏水98毫升 苏木精稀释液:成熟Delafield苏木精溶液1毫升用蒸馏水稀释20倍(1:19) 材料:出生3~6天的小动物胫骨或股骨 方法:苏木精-天青Ⅱ-伊红染色法 固定:10%甲醛或含升汞固定液 脱钙:EDTA 各级酒精脱水至95%酒精,脱水时间比常规减少1/3 正丁醇脱水透明 正丁醇-软蜡(1:1)媒浸 常规浸蜡 包埋 切片5~6微米 切片脱蜡 经无水酒精,滴加0.1%火 棉胶液(乙醚酒精等量混合液配制)防止切片剥离,升汞固定者需作脱汞处理 经各级酒精下行至水 稀苏木精染色2~3小时,分色3~6分钟,流水冲洗 天青Ⅱ伊红液染60~90分钟 直接入95%酒精速洗 无水酒精脱水 二甲苯透明 树胶封片 结果:软骨基质蓝色(嗜碱性) 新生的类骨质中无钙盐沉积,呈嗜酸性 成骨细胞粘附于骨组织表面,单层排列,呈矮柱状,有短突起,胞质嗜碱性呈蓝色 破骨细胞位于骨质表面的小凹陷内,核多个,胞质嗜酸性,呈红色或紫色 Weigert苏木精染色法 新鲜骨组织用10%甲醛液固定,正丁醇脱水,石蜡包埋,苏木精伊红染色,可观察骨细胞核和骨胶原纤维 10%甲醛液固定7天以上,水洗 Plank液脱钙,流水冲洗48小时 50%酒精脱水至95%酒精 正丁醇脱水兼透明8~12小时 正丁醇-软石蜡等量混合液8~12小时 常规浸蜡,包埋 石蜡切片8~10微米 Weigert铁苏木精溶液染色5~10分钟 Weigert铁苏木精液 甲液:苏木精1克,95%酒精100毫升 乙液:29%三氯化铁4毫升,盐酸1毫升,蒸馏水95毫升 等量混合,用几天 过染则用0.5%盐酸酒精分色,流水冲洗 伊红染色 各级酒精脱水 二甲苯透明 树胶封片 结果:脱钙骨骨小管不明显,哈佛氏骨板呈环行排列,深浅不同,呈蓝色或紫色 脱钙后要用流水充分部首,否则不易着色;骨组织切片用酒精 脱水不易切片;Weigert铁苏木精对脱钙骨染色较好,染色时间短,能长期保存,不易脱色。 Tappen镀银法(1965) 新鲜骨组织用10%甲醛固定 硝酸或改良Plank液脱钙,硫酸钠中和,充分水洗(2~4小时 ) 入氨银液36~72小时(25℃),蒸馏水洗 氨银液:10%硝酸银(Silver nitrate)水溶液5毫升加氨水至沉淀溶解,加蒸馏水至50毫升 冰冻切片10~30微米 切片脱水,透明,封固 结果:骨小管、骨陷窝棕黑色,哈佛氏骨板棕褐色
四、脱水 单纯脱水:酒精、丙酮 脱水兼透明:正丁醇、叔丁醇、松脂醇、二氧陆环 (一)酒精 一般从70%酒精开始,直到无水酒精 胚胎组织应从35%酒精甚至10%酒精开始脱水 结缔组织及脂肪组织较多的器官增长脱水时间 肝、脾、肾、淋巴结等减少脱水时间 10%酒精→35%酒精 →50%酒精→70%酒精→80%酒精→90%酒精→95%酒精Ⅰ→95%酒精Ⅱ→无水酒精Ⅰ→无水酒精Ⅱ 一般组织 胚胎组织 (二)正丁醇 酒精脱水至无水酒精,正丁醇2~3次各1~4小时,转入石蜡 (三)松脂醇 各级酒精脱水至无水酒精,松脂醇(Terpinol)2~3次各1~4小时,转入石蜡 (四)石炭酸二甲苯 用于火棉胶切片脱水;铺片标本染色后脱水 五、透明 二甲苯、甲苯、苯;冬青油、苯甲酸甲酯、水杨酸甲酯(Methyl salicylate)、苯胺油;氯仿、乙醚酒精 进入二甲苯时发浑,脱水不彻底,返回酒精继续脱水 无水酒精二甲苯之间可经1:1或/和1:2~3处理 冬青油或苯甲酸甲酯:经脱水至95%酒精,直接透明至组织下沉 乙醚酒精和氯仿透明一般用于火棉胶切片 六、浸蜡和包埋 (一)浸蜡 肝、脾减少浸蜡时间 脂肪组织和纤维较多的组织延长浸蜡时间 室温低(冬天)用45~48℃熔点石蜡;室温高(夏天)用58~62℃石蜡 蜡温比石蜡熔点高2~3℃ 加热除水分和杂质 二甲苯尽量少 (二)包埋 模具比组织大2毫米;切面朝下;组织放在模具正中央 七、切片和粘片 (一)切片 切片机切片:固定组织块和刀片;角度4~6度;匀速摇动手轮;厚度2~10微米(一般5~10微米,免疫组化2~5微米) (二)粘片 水捞法:水温40~50℃,载玻片正中偏右,60~70℃烤1~2小时或37℃温箱烤干 干粘法:载玻片涂上蛋白甘油;滴一滴水;将切成单片的组织放在水滴上;在加热板上加热,组织展开;用镊子等工具将组织拉平;立干;烘烤 八、染色和封固 (一)染色 根据显示内容选择染色方法 对不同固定液选择不同染色方法 切片前的染色(块染)与切片后的染色(切片染色) 1 常用染液: Delafield苏木精、Harris苏木精、Ehrlich苏木精、Mayer苏木精 ⑴Delafield苏木精: 苏木精4克溶于无水酒精25毫升, 倒入10%铵明矾(Ammonium alum)水溶液400毫升, 放有光处3~4天,过滤 加甘油及甲醇各100毫升 数天后过滤 ⑵Ehrlich酸性苏木精: 苏木精2克溶于95%酒精100毫升,加蒸馏水及甘油各100毫升,钾明矾3克,冰醋酸10毫升 混合后溶液呈红色,用纱布封闭 两周后成熟,溶液呈暗红紫色 ⑶Harris苏木精 10%钾明矾水溶液200毫升加热溶解 倒入已溶解的10%苏木精95%或无水酒精溶液10毫升 继续加热煮沸1分钟,停火 缓慢加入氧化汞(Mercury oxide)0.5克 加热煮沸1分钟 速放冷水冷却 可加冰醋酸6~10毫升增加细胞核着色力 ⑷Weigert铁苏木精: A液:1%苏木精95%酒精溶液10毫升 B液:氯化铁(Ferric chloride)1.16克,溶于蒸馏水98毫升,加盐酸1毫升 用时将两液等量混合 ⑸Mallory磷钨酸苏木精 苏木精10克,蒸馏水100毫升,加磷钨酸(Phosphotungstic acid)2克 加新鲜双氧水(Hydrogen peroxide)0.2毫升或0.25%高锰酸钾(Potassium Permanganate)水溶液10毫升 切片染色12~24小时,流水冲洗 卡红: ⑹Grenacher钾明矾卡红染液——纯细胞核染液 3~5%钾明矾或铵明矾水溶液100毫升,加卡红(Carmine)2克,混合煮沸1小时,冷后过滤 加甲醛1毫升,加蒸馏水至100毫升 切片染色1~24小时,充分水洗至不褪色 ⑺Grenacher硼砂卡红液: 4%硼砂(Borax)水溶液100毫升,卡红2克,混合,加温溶解,冷后过滤,加70%酒精100毫升 切片染5~10分钟,盐酸酒精分色 鸡胚整体染色1~3天,盐酸酒精分色 ⑻Orth锂卡红染液: 碳酸锂饱和水溶液100毫升,卡红3~5克,加温煮沸15分钟,冷后过滤 切片染2~5分钟,盐酸浅床分色 ⑼伊红:伊红Y(Eosin Yellowish) 0.5~1克 95%酒精100毫升 ⑽复制伊红(0.5%酒精溶液): 伊红0.5克溶于蒸馏水5毫升 加冰醋酸10滴,搅拌 加蒸馏水10毫升,再加冰醋酸10滴,产生红色沉淀 加蒸馏水4毫升,过滤 沉淀和滤纸放60℃温箱烘干 加95%酒精100毫升 ⑾Mayer硫堇水溶液:硫堇(Thionin)1克 蒸馏水100毫升 切片染色12~24小时,95%酒精分色 结果:细胞核蓝色;黏液、软骨基质、肥大细胞颗粒紫蓝色 切片经5%铁明矾(Ammonium iron(III) sulfate dodecahydrate )水溶液媒染45分钟,水洗,入硫堇液染色10~20分钟,50%酒精分色,5%钼酸铵水溶液5~10分钟 ⑿Mayer甲苯胺蓝染液: 甲苯胺蓝(Toluidine bule)1克,蒸馏水100毫升 切片染色12~24小时,95%酒精分色 结果:细胞核蓝色;黏液、软骨基质、肥大细胞颗粒紫蓝色 切片经5%铁明矾水溶液媒染45分钟,水洗,入甲苯胺蓝液染色10~20分钟,50%酒精分色,5%钼酸铵(Ammonium molybdate)水溶液5~10分钟 沙黄染液: ⒀Winwarter沙黄液: 沙黄G(Safranin G) 10克,95%酒精155毫升,蒸馏水145毫升。用时取20毫升加50%酒精50毫升。 染24小时,95%酒精分色。结果:细胞核红色 ⒁Flemming沙黄液: 沙黄(Safranini)1克,无水酒精100毫升,溶解后加蒸馏水50毫升 切片染色数小时,50%酒精分色 ⒂Babes苯胺沙黄液 沙黄2~3克,2%苯胺油水溶液100毫升,加温溶解冷却过滤, 切片染色24小时。只能用一个月。 ⒃油红O溶液:油红O(Oil Red O)1克,60%异丙醇(isopropylalcohol)100毫升 ⒄醛品红溶液:碱性品红(Fuchsine base)0.5克溶于70%酒精100毫升,加浓盐酸及三聚乙醛(Paraldehyde)各1毫升,放置24小时,染液呈深紫色,冰箱保存备用。 ⒅雷琐辛碱性品红液(弹性纤维):Weigert来复红NewFuchsin液 弹性纤维染色 碱性品红(Fuchsine base)1克,间苯二酚(Resorcin)2克,蒸馏水100毫升(有现成的试剂New Fuchsin出售) 溶解煮沸 加29%三氯化铁(Ferric chloride)水溶液12.5毫升 搅拌,加热2~5分钟 冷后过滤 滤纸加滤液在温箱烤干 沉淀物加滤纸放入95%酒精100毫升 加水至100毫升 加浓盐酸2毫升,摇匀,密封冷存可用数月 ⒆地衣红溶液:弹性纤维染色 地衣红(Orcein)1克,70%或80%酒精100毫升,浓盐酸1毫升 ⒇Schiff试剂 蒸馏水200毫升煮沸,停火 加入碱性品红1克,搅拌溶解 冷于50℃,加1N盐酸20毫升 冷至室温(25℃),加偏重亚硫酸钠(Sodium metabisulfite)或钾(Patassium metabisulfite)1克,摇荡,暗处过夜 加活性碳(Active carbon)2克,充分摇荡数分钟 过滤。滤液呈无色或淡黄色 置棕色瓶于冰箱4℃保存 1N盐酸:浓盐酸(36~38%,比重1.19)8.5毫升加蒸馏水至100毫升 亚硫酸水 10%无水亚硫酸钠(Sodium sulfite)10毫升,自来水200毫升,1N盐酸溶液10毫升 醋酸水:冰醋酸0.5~1毫升,蒸馏水100毫升 (21)甲基绿-派洛宁染液: 2%甲基绿水溶液3毫升 5%派洛宁G水溶液1毫升:派洛宁 (Pyronin)5克加蒸馏水100毫升,置40℃温箱加温溶解,边加温加搅拌至完全溶解,过滤备用 0.2M醋酸缓冲液(pH5.1)8毫升 蒸馏水8毫升 附:甲基绿染料提纯 甲基绿(Methyl green)2克溶于蒸馏水100毫升,装入分液漏斗,加适量氯仿,充分摇荡; 静置,甲基紫(Methyl violet)溶于氯仿而呈紫色,弃去氯仿部分,保留水溶性部分 连续用氯仿处理,直到氯仿中没有紫色为止 置于冰箱备用 (二)封固 干封法:脱水、透明、封片 湿封法:水或甘油(明胶)封片,用于分离标本,整装卵细胞及易被酒精或二甲苯溶解的脂类或组化显示的酶 组织染色后滴加水溶性液体(湿性封固剂)封片。湿性封固剂主要含甘油和明胶,易蒸发。为防止液体蒸发,用漆将盖玻片周围封闭 封固剂:纯甘油加蒸馏水2倍及少量石炭酸防腐,或甘油10毫升加95%酒精10毫升,混合后加蒸馏水20毫升。对分离的运动终板则用甘油甲醛等量混合液 固体水溶性封固剂: Kaiser甘油明胶:明胶7克加温溶于蒸馏水42毫升,加甘油50毫升,石炭酸 0.5克 明胶50克加蒸馏水175毫升,加温熔化,加甘油150毫升 Fischer甘油明胶:硼砂5克溶于蒸馏水240毫升,加甘油25毫升,明胶40克 甘油明胶常温呈固态,用前加温熔化,滴于标本上,立即加盖玻片封固 Baker改良Squire法:明胶5克溶于蒸馏水25毫升;另取甘油35毫升加蒸馏水400毫升和石炭酸0.25克。待明胶熔化后与甘油石炭酸水混合 第三部分 块染法 苏木精伊红块染法 材料:平滑肌、心肌;小脑;长骨发育;消化管(咽至大肠、阑尾);皮肤(体皮、掌皮、头皮);肺、气管;睾丸、附睾、前列腺、精囊;卵巢、输卵管、子宫、乳腺;甲状腺、肾上腺;淋巴结;内耳;膀胱;等 固定液:10%甲醛,Bouin液,固定1~3天 苦味酸固定:70%酒精(加几滴氨水或碳酸锂饱和水溶液)1~3天,每天换几次,脱去黄色 甲醛固定:流水冲洗24小时,蒸馏水洗 10%冰醋酸70%酒精溶液(冰醋酸10毫升,70%酒精90毫升)24~48小时 10%Harris苏木精或Ehrlich苏木精水溶液或70%酒精溶液5~10天,换一次液;流水稍洗 10%冰醋酸(70%)酒精液分色2~3小时至更长,随时换几次液 自来水冲洗1~2小时 0.5%氨水还原2~3小时 自来水冲洗24小时,蒸馏水略洗 50%酒精过夜 70%酒精过夜 0.5%复制伊红70毫升+蒸馏水25毫升,染3天 0.5%复制伊红80毫升+蒸馏水15毫升,染3~5天 95%酒精(加几滴伊红)3小时 95%酒精2小时(头皮、指皮、空肠等过夜) 无水酒精2次共2~3小时 无水酒精二甲苯(1:1)30~45分钟 二甲苯三次各10分钟 石蜡3~4次各30~50分钟 石蜡包埋 较大组织块,脱水、透明、浸蜡时间相应延长 碘酸钠苏木精块染法显示心肌闰盘 试剂: 碘酸钠苏木精:苏木精0.1克,钾明矾5克,碘酸钠0.02克,蒸馏水100毫升 将明矾溶于蒸馏水;依次加入苏木精和碘酸钠(或高锰酸钾)。现用现配 方法: 材料:1~2毫米厚的心肌(兔、狗、猪、牛、猴)小块组织 固定:ADN液24小时 70%酒精酒精4小时 50%酒精4小时 蒸馏水洗 苏木精液15天以上 流水冲洗24小时 脱水:常规 透明:常规 浸蜡:常规 包埋:常规 切片:6微米,粘片,干燥 脱蜡,封片 结果:心肌闰盘蓝至黑色 Masson块染法显示胃肠内分泌细胞(嗜银细胞) 组织材料:消化管的腺体和胰岛等 固定:Bouin液3~7天,流水冲洗24小时 稀氨水(氨水2~3滴加蒸馏水100毫升)24小时,经常摇荡,可换一二次液 镀银:室温下入氨银液24~48小时,经常摇荡;蒸馏水洗(换洗两三次) 氨银液:20%硝酸银水溶液逐滴加入氨水,随加随摇至沉淀消失,溶液透明,再滴入20%硝酸银水溶液2~3滴,溶液稍混浊,无氨味。加蒸馏水至20毫升,暗处,用前过滤,再加蒸馏水1:3 分色:24小时,去掉多余沉淀;蒸馏水洗2~3小时,每30分钟换一次水 分色液:硫氰化铵(Ammonium thiocyanate)3克,蒸馏水100毫升,1%氯化金(Gold trichloride)水溶液1~2毫升 各级酒精脱水,透明,石蜡包埋,切片6微米 切片贴片,烘干,二甲苯脱蜡,加树胶封固 结果:嗜银细胞颗粒小,呈黑色;上皮细胞核内的核质棕色 第四部分 切片染色法 一、常规染色法 苏木精伊红染色法 石蜡切片粘片后烘干(无水) 经两次二甲苯脱去组织上的石蜡(脱尽石蜡) 无水酒精洗涤两次(洗去二甲苯,也可判断脱蜡是否干净) 快速经95%、90%、80%、70%酒精至水(含汞固定者经70%酒精后以碘酒精脱汞,以5%硫代硫酸钠水溶液去碘再染色;Bouin液固定者,在80%和70%酒精内放至黄色基本脱去;每一级时间数秒;为减少水里的酒精过多,可在70%酒精后增加 50%、35%和10%等级别的酒精) 蒸馏水洗(洗去切片上的酒精) 苏木精染色5~15分钟(冬天可加温并延长染色时间,Zenker液固定者延长) 自来水洗去多余的染料 用盐酸酒精或盐酸水分色至细胞核呈红紫色,胶原纤维、肌纤维和细胞质结缔组织基本无色 70%酒精洗涤后入氨酒精返蓝或快速经流水洗涤至细胞核呈蓝色 经80%、90%、95%酒精(洗去组织上的氨,以免影响伊红着色) 0.5~1%伊红溶液染色数秒至数分钟(对比染色) 95%酒精分色两次(洗去浮色,结缔组织和细胞质呈桃红色) 无水酒精脱水两三次(脱尽水分) 二甲苯透明2~4 次(发浑则重换无水酒精脱水) 中性树胶加盖玻片封固 结果:细胞核蓝紫色,胶原纤维、肌纤维、嗜酸性颗粒桃红色,细胞质桃红色,弹性纤维亮红色 含重铬酸钾混合液固定的组织,细胞核着色不鲜艳;甲醛长期固定的组织,细胞核着色也困难,经自来水充分洗涤,再用碳酸锂饱和液中和10分钟或更久再染色。Sus液、甲醛酒精液、Bouin液固定则着色较好。不同组织的着色不尽相同 二 特殊染色法 (一)成纤维细胞 铁矾苏木精染色法(成纤维细胞) 结缔组织铺片:固定于酒精甲醛醋酸液(AFA)30~60分钟,水洗1小时 固定于Zenker液30~60分钟,水洗1小时,脱汞去碘 2%铁明矾水溶液媒染2~4小时(冬天37 ℃),蒸馏水洗2次 苏木精染色4~8小时(37℃温箱1~2小时),流水洗 苏木精染液:10%苏木精无水酒精溶液100毫升加甘油5毫升,放几周;用时取5~10毫升加蒸馏水至100毫升 2%铁明矾水溶液分色至核呈蓝色、胞质呈淡灰蓝色 水充分洗涤并浸泡于水中5分钟 0.5%复制伊红酒精溶液或1%荧光桃红水溶液3~5分钟 95%酒精分色,无水酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片 结果:成纤维细胞和组织细胞细胞核蓝色,细胞质灰至灰蓝色 (二)肥大细胞 甲苯胺蓝染色法(肥大细胞) 材料:皮下组织,肠系膜 固定:10%甲醛,甲醛酒精醋酸液,Helly液 0.3~0.5%甲苯胺蓝50%酒精溶液1~3分钟,水洗 也可0.01%伊红复染 95%酒精分色,无水酒精脱水 二甲苯透明,中性树胶封片 结果:肥大细胞颗粒紫色 甲苯胺蓝法 0.5%甲苯胺蓝液:甲苯胺蓝(Toluidine blue)0.5克溶于蒸馏水100毫升 0.5%冰醋酸溶液:冰醋酸0.5毫升,蒸馏水100亳升 染色 固定:10%甲酸生理盐水或甲醛酒精液 甲苯胺蓝液20~30分钟,水稍洗 冰醋酸溶液分色至细胞核和肥大细胞颗粒清晰,水稍洗 用电吹风吹干 二甲苯透明,中性树胶封片 结果:肥大细胞颗粒红紫色,细胞核蓝色 硫堇染色法(肥大细胞) 材料:皮下组织,肠系膜 固定:10%甲醛,甲醛酒精醋酸液,Helly液 0.1%硫堇(Thionin)水溶液染1~3分钟,水洗 0.2M醋酸分色,95%酒精和无水酒精脱水 结果:肥大细胞颗粒紫色 醛品红-橙黄G染色法 组织固定于甲醛生理盐水溶液 切片脱蜡至70%酒精 醛品红液10~15分钟 70%酒精分色,洗去多余染料,水稍洗 橙黄G液1秒,水稍洗 酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封固 结果:肥大细胞颗粒紫红至深紫;弹性纤维深紫色;红细胞鲜橙黄色;其余组织淡黄色 (三)浆细胞 天青Ⅱ伊红染色法 材料:慢性炎症组织如鼻息肉等;正常组织如小肠、淋巴器官等 固定:10%甲醛或Zenker液 切片:3~5微米 染色:30~45分钟,用吸水纸吸干 天青Ⅱ伊红液 0.4%天青Ⅱ(Azure II)水溶液4毫升 0.1%伊红(Eosin Y/B)水溶液6毫升 0.2M醋酸(Acetic acid)水溶液1.7毫升 0.2M醋酸钠(Sodium acetate)水溶液0.3毫升 丙酮(Acetone)5毫升 丙酮-无水酒精等量混合液分色数秒(镜检:浆细胞核质颜色分明),吸干切片 二甲苯透明,中性树胶封片 结果:浆细胞车轮状核深蓝色、胞质深蓝至灰蓝;红细胞红色 (四) 脂肪细胞 油红O染色法(脂肪、脂滴、类脂) 方法: 冰冻切片15微米或更薄,捞于载玻片上,用60%异丙醇淋洗 油红O(Oil red O)液染色15分钟 60%异丙醇(Isopropyl alcohol)分色至背景无色 明矾苏木精染核,分色,充分水洗 脱水,透明,封片 结果:中性脂肪红色,核蓝色 (五)胶原纤维 Mallory三色染色法(肌原纤维,肌组织) 固定:Zenker、Helly、Bouin液;甲醛+切片经Zenker或Bouin液媒染 切片:不超过8微米 染色:脱蜡至水 0.5%酸性品红水溶液5分钟,蒸馏水速洗 苯胺蓝橘黄G液10~20分钟 苯胺蓝(Ainlin blue) 0.5克,橘黄G (Orange G)2克,磷钼酸(Phosphomolybdic acid hydrate)或磷钨酸(Phosphotungstic acid)1克,蒸馏水100毫升 95%酒精脱水2~3次 无水酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片 结果:胶原纤维深蓝色;软骨基质、骨基质、黏液等呈蓝色;细胞核红色;红细胞橘黄色;肌肉紫红色 Heidenhain Azan(偶氮卡红苯胺蓝)染色法(胶原纤维) 固定:Zenker液,Helly液,Bouin液,Carnoy液,12~24小时 染色:1%苯胺(安尼林Aniline)95%酒精溶液30~60分钟 95%酒精1分钟 0.1%偶氮卡红B或G水溶液37℃温箱8~12小时 偶氮卡红液:偶氮卡红1克,蒸馏水100毫升。用时取10毫升加蒸馏水90毫升,冰醋酸0.5~1毫升 切片冷却至室温,用蒸馏水略洗 0.1~1%苯胺酒精溶液分色至细胞呈深红色,肌纤维红色,其它纤维无色或微红色 快速入含1%醋酸95%酒精溶液30~60秒,蒸馏水略洗 5%磷钨酸水溶液1~3小时,蒸馏水略洗 苯胺蓝-橘黄G液15~30分钟。随时镜检,避免过染。或改用0.25~0.5水溶液染色1~3小时 苯胺蓝0.5克,橘黄G 2克,蒸馏水100毫升,冰醋酸8毫升 混合煮沸,冷却后过滤 流水洗去多余染料 95%酒精分色至蓝黄分明 无水酒精脱水1~2分钟,二甲苯透明,中性树胶封片 结果:胶原纤维蓝色;肌纤维深红色;弹性纤维主黄色;细胞核红色;红细胞橘黄色 本法能染胰岛和垂体前叶细胞 Mallory-Heidenhain Azan染色法(肌原纤维、弹性纤维,胰岛,垂体腺细胞) 材料:豚鼠或小狗小块胰腺(尾部) 固定:Helly液24小时;Bouin液24小时以上。流水冲洗24小时 切片:厚4~6微米 脱蜡经酒精下行至水;碘酒和硫代硫酸钠脱汞,水洗 偶氮卡红液(在温箱预热至60℃)56~60℃1小时,切片冷至室温后水洗 偶氮卡红液:偶氮卡红G0.1克或偶氮卡红B 0.25~1克,蒸馏水100毫升,煮沸5分钟,冷后过滤,加冰醋酸1毫升 1%苯胺95%酒精溶液分色1~2分钟至B细胞鲜红色、其它细胞胞质淡红或无色 95%酒精洗去苯胺油 经各级酒精下行入水 5%磷钨酸水溶液或2%铁明矾水溶液媒染1~3小时可过夜 蒸馏水洗或直接入苯胺蓝橘黄G液染1~3小时(可过夜) 苯胺蓝-橘黄G液:苯胺蓝(或亮绿或坚牢绿)0.5克,橘黄G 2克,蒸馏水100毫升,煮沸,冷后过滤,加冰醋酸8毫升。染结缔组织,用蒸馏水稀释3倍;染胰岛不稀释。 蒸馏水速洗或直接入95%酒精分色至A细胞呈橘黄色 无水酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片 结果:A细胞橘黄色;B细胞红色;D细胞淡蓝色;腺泡细胞酶原颗粒橘黄色;细胞核红色 Van Gieson染色法 固定:常用固定液 方法: Weigert苏木精或其它苏木精深染,蒸馏水速洗(去除多余染料) VanGieson液1~2分钟,蒸馏水速洗或用吸水纸吸干 VanGieson液:1%酸性品红(Acid Fuchsin)水溶液10毫升,苦味酸饱和水溶液90毫升 95%酒精分色10~30秒,用吸水纸吸干 无水酒精脱水30~60秒,用吸水纸吸干 二甲苯透明1~2分钟 中性树胶封片 结果:胶原纤维品红色;肌纤维细胞质灰黑色 (六)弹性纤维 地衣红染色法(弹性纤维) 固定:10%甲醛液,甲醛酒精液;Helly液 染色: 地衣红液37℃15~30分钟(室温1~2小时),70%酒精洗去染液(不能停留过久) 地衣红液:地衣红1克,浓盐酸1毫升,70%或80%酒精100毫升,数小时可用 水洗,蒸馏水洗1分钟 苏木精染核;伊红复染 酒精脱水,二甲苯透明 ,树胶封片 结果:弹性纤维深棕色,细胞核蓝色,结缔组织红色 Weigert雷琐辛-碱性品红染色法(弹性纤维) 固定:Zenker液、Helly液或10%甲醛液 Weigert液染弹性纤维30~60分钟(37℃15~30分钟) 水洗多余染料,蒸馏水洗一次 苏木精染核5~10分钟,水洗 0.5%盐酸酒精分色10~15秒,水洗至核呈蓝色 Van Gieson液3~5分钟,蒸馏水速洗 95%酒精分色1~2分钟 无水酒精脱水1~2分钟 二甲苯透明 中性树胶封片 结果:弹性纤维蓝黑色;胶原纤维红色;肌纤维黄色;细胞核深蓝色 Gomori醛品红染色法(弹性纤维、胰腺) 固定:10%甲醛液,甲醛酒精液,Bouin液 0.5%高锰酸钾水溶液1~2分钟,流水洗 1%草酸水溶液1分钟,水洗1分钟 50%酒精1~2分钟 醛品红液5~15分钟(冬天37℃温箱10分钟),蒸馏水速洗 95%酒精分色至背景无色, 蒸馏水洗30~60秒 1%亮绿水溶液2~5分钟,蒸馏水速洗 95%酒精分色至纤维颜色分明 无水酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片 结果:弹性纤维紫色;胶原纤维绿色;细胞核紫红色 能很好显示血管壁、肺泡壁、皮肤等组织中的弹性纤维 (七)网状纤维 Gomori染色法 固定:10%甲醛液,Zenker液或Susa液 0.5%或1%高锰酸钾(Potassium permanganate)水溶液2分钟,流水洗 3%亚硫酸钾(Potassium Pyrosulfite)或草酸(Oxalic acid)2分钟,流水洗 2%铁明矾(Ammonium iron(III) sulfate dodecahydrate)水溶液3分钟,蒸馏水洗2~3次约2分钟 氨银液1~5分钟(冬天37℃温箱),蒸馏水速洗两次 氨银液:10%硝酸银( Silver nitrate)20毫升,加10%氢氧化钾(Potassium hydroxide)水溶液4毫升,产生灰黑色沉淀。充分振摇,至沉淀沉底,倾去上清液。将沉淀用蒸馏水洗3~4次,边加氨水边摇至沉淀完全溶解,再滴加10%硝酸银几滴,使溶液稍混,加浓氨水使溶液清亮。最后加蒸馏水稀释至100毫升。保存于棕色瓶备用 5%甲醛水溶液5分钟(还原),流水洗 0.2%氯化金(Gold trichloride)水溶液调色3分钟,蒸馏水洗 3%亚硫酸钾(Potassium Metabisulfite)水溶液1分钟,蒸馏水洗 2%硫代硫酸钠(sodium hyposulfite)水溶液1分钟,蒸馏水洗 95%和无水酒精脱水 二甲苯透明 中性树胶封片 结果:网状纤维黑色 ;细胞核灰黑色 ;胶原纤维深黄色 Wilder染色法 固定:10%甲醛液或Zenker液 0.25%高锰酸钾水溶液或10%磷钼酸水溶液1分钟 10%氢溴酸(Hydrobromic acid)水溶液1分钟(可略) 流水洗,蒸馏水洗 1%硝酸铀(Uranyl nitrate hexahydrate)水溶液3~5秒,蒸馏水速洗 氨银液1~2分钟 氨银液:10%硝酸银5毫升,逐滴加氨水至出现沉淀并恰好溶解;加3.1%氢氧化钠(Sodium hydroxide)水溶液5毫升,产生沉淀,滴加氨水溶解。加蒸馏水至100毫升,过滤后使用 95%酒精速洗 1%甲醛与0.03%硝酸铀水溶液1分钟或稍长,蒸馏水洗30~60秒 0.2%氯化金1分钟,蒸馏水速洗 5%硫代硫酸钠水溶液2~3分钟,蒸馏水2~3娩 Van Gieson液3~5分钟或不复染。蒸馏水洗并沾干 95%酒精和无水酒精伊通痧 二甲苯透明,中性树胶封片 结果:网状纤维黑色;胶原纤维红色;肌纤维黄色 (八) 神经元尼氏体 尼氏染色法(神经元尼氏体或嗜染质) 固定:80%酒精,Carnoy液,中性甲醛或甲醛生理盐水溶液 切片:石蜡切片8~10微米,冰冻切片15~20微米 焦油紫染色20~30分钟(60℃温箱3~10分钟),蒸馏水洗 染液:焦油紫(Cresyl violet acetate)0.1克,蒸馏水99毫升,1%冰醋酸水溶液1毫升 95%酒精分色。 分色液:95%酒精90毫升,氯仿10毫升,冰醋酸1~3滴 无水酒精几次,二甲苯充分洗涤 树胶封片 z结果:尼氏体紫色,核淡紫色 (九 ) 肌梭 肌梭是外包结缔组织被囊的梭形小体,内面的骨骼肌纤维形态特殊称梭内肌纤维,梭内的神经纤维无髓鞘 Faworsky法 取材:猫后腿外展肌一小块,贴于滤纸上,固定于冰醋酸酒精溶液(70%酒精 50毫升,冰醋酸1.5毫升)1天以上,最好10天左右 50%酒精 数小时 含1%氨水的95%酒精(95%酒精100毫升,氨水1毫升)2天 蒸馏水洗至组织下沉 纯吡啶(Pyridine)不超过2天 流水冲洗12~24小时无吡啶味,蒸馏水洗数次 2%硝酸银水溶液37℃恒温染色10天左右 还原12~24小时,蒸馏水速洗 焦性没食子酸(Pyrogallol)1克,蒸馏水50毫升,中性甲醛5毫升 脱水 ,透明石蜡包埋 时间尽量缩短 连续切片15微米 切片脱蜡,透明,镜检,树胶封片 结果:骨骼肌纤维黄棕色,横纹清晰;肌梭神经纤维黑色 肌梭见于所有肌肉,四肢肌多于躯干肌,手、足肌肌梭特别多。多取材于指或趾间肌。取猫的后腿外展肌 附:内耳神经眼神经肠肌间神经游离神经末梢 Golgi法Ⅰ 显示神经细胞胞体及树突轴突(黑色);神经胶质细胞、毛细血管周细胞;硬骨哈佛氏系统的使佛氏管、腺细胞的细胞内分泌小管及肝脏胆小管(毛细胆管)、 取新鲜脑组织厚经1厘米左右或从已固定的整脑切取小块组织固定于10%甲醛液至少24小时,或3.5%重铬酸钾水溶液甲醛液(3:1)3天左右,每天换一次新液 神经胶质细胞 2~3天 大脑皮质细胞 3~4天 小脑皮质细胞 4~5天 脊髓灰质 4~5天 轴索及无髓神经纤维 5~7天 第三天起,每天取一块组织以以少量0.75~1%硝酸银水溶液荡洗几次直到不再出现红褐色沉淀 放入盛有大量硝酸银水溶液的瓶内,每100毫升银淮加蚁酸数滴,置暗处2~6天,隔日换银液一次 水速洗一次 用锋利刀片切取一小薄片组织滴少量甘油镜检,如不满意,重复上面两个步骤。 组织块经95%酒精和无水酒精各2小时 乙醚酒精1小时 5%火棉胶液1~2小时 10%火棉胶液1~2小时 火棉胶硬化和包埋,切片20~100微米 经95%酒精速用滤纸沾净 入透明液,捞于载玻片上,用滤纸沾净 透明液:白色石炭酸结晶10克,甲苯或二甲苯80毫升,木馏油(Creosotum)10毫升 甲苯或二甲苯洗几次(除去透明液中的石炭酸) 用树胶甲苯液或加拿大树胶封片 或切片经95%酒精后用滤纸沾净,直接用山达胶透明封片 山达胶(Gum sandarac )75克,樟脑15克,松节油30毫升,熏衣草油(Lavander oil)22.5毫升,无水酒精75毫升, 蓖麻油(Castor oil)5~10滴 不加盖片,置避尘处阴干 Cajal水合氯醛法(Cajal VI) 适于神经终末装置,如运动终板、突触,脊神经节的假单极神经元突起等 组织2~5毫米厚固定于水合氯醛液24小时,水洗数分钟 水合氯醛液:水合氯醛5.5克,无水酒精25毫升,蒸馏水75毫升 氨酒精液24小时,用滤纸沾净 氨酒精:95%酒精50毫升,氨水3~4滴 1.5%硝酸银水溶液37℃暗处镀银4~6天(室温暗箱内延长一倍时间)至组织呈淡灰黄色 水洗几次(60秒内) 还原液18~24小时 还原液:焦性没食子酸或对苯二酚1克,蒸馏水100毫升,甲醛液(37~40%)5~10毫升,可加亚硫酸钠0.1~0.5克防止还原液过早失效 焦性没食子酸作用缓和,色调均匀,还原时间稍长 水洗一次 经70%酒精 上行脱水。透明,浸蜡,包埋,切片10微米,烘干 切片脱蜡下行酒精至水,可用0.2%氯化钠水溶液调 色及5%硫代硫酸钠水溶液洗涤,水洗 脱水,透明,封片 结果:神经纤维和神经元黑色,背景黄褐色 Ranson吡啶银法(无髓神经纤维) 组织固定于氨酒精48小时,水略洗 无水酒精100毫升加氨水1毫升,或95%酒精100毫升加氨水5毫升 纯吡啶24小时充分水洗1天(洗去吡啶味) 2%硝酸银水溶液3天(暗处35℃),水略洗 还原液24~48小时,水洗 还原液:焦性没食子酸4克,4%甲醛100毫升 常规硬蜡包埋,切片,烘干 切片脱蜡,加树胶封片 结果:较大块组织色泽均匀能很好显示各种神经节,胞体黄棕色,突起黑色,无髓神经纤维黑色,有髓神经纤维黄棕色 吡啶银法显示毛囊神经末梢 取幼年小鼠上唇小块固定于吡啶蒸馏水等量溶液2天,充分水洗1天,除去吡啶 将组织浸入大量无水酒精内2天,用滤纸沾干 37℃温箱避光浸1%硝酸银水溶液5天,水速洗 还原液1天,水洗 还原液:蒸馏水40毫升,40%甲醛液10毫升,焦性没食子酸1克 常规脱水透明,石蜡包埋,切片 结果:神经纤维黑色其它组织黄色 De Castro内耳双极神经元显示法 取下幼年豚鼠内耳,剔除其外表的软组织,固定兼脱钙于下液1~5天,至针能刺入骨 水合氯醛5克,95%酒精50毫升,蒸馏水50毫升,硝酸3~5毫升 流水冲洗1天 0.5%氨95%酒精溶液24小时,用滤纸沾干 1.5%硝酸银水溶液7天(37℃避光),隔日换银液一次 还原2天,水洗 还原液:焦性没食子酸或对苯二酚1.5克,甲醛8毫升,蒸馏水100毫升 脱水,透明,石蜡包埋,切片12~15微米 结果:骨组织黄色;神经元突起及神经纤维黑色 肌间神经丛镀银法 幼年豚鼠、兔或猫及成年豚鼠和兔杀死,剖腹取小肠一段(长数厘米至20厘米),用热生理盐水注入肠腔,将其内污物冲洗干净 结扎肠段的两端,用细针头注射器将固定液缓慢注入肠段(穿刺肠壁或通过结扎口),使肠管膨胀 60%酒精90毫升,甲醛10毫升 将膨胀的肠管全部固定于上述固定液3天或1~3周 将肠管剪成1厘米小段,自来水冲洗12小时 用大量蒸馏水浸泡24~36小时,换水3~4次(不宜过长,否则不易着色) 将肠管沿肠系膜处纵行剪开,平铺成一方形薄片 用眼科镊镊尖夹紧组织,放在蒸馏水洗内,轻轻而骤然撕去黏膜、黏膜下层和环行平滑肌层,只留下肌间神经丛在薄的纵行肌层上,在解剖镜下很容易看到 挑选较好的神经丛和纵行肌层同时放入新配的20%硝酸银充满活力溶液内37℃避光5~20分钟或5%硝酸银水溶液37℃1天 蒸馏水速洗一次(30秒) 还原5~10分钟(37℃),水洗 还原液:对苯二酚1.5克,中性甲醛3毫升,蒸馏水100毫升 分色至组织呈蓝黑色 硫氰化铵(Ammonium thiocyanate)3克,蒸馏水100毫升,溶解后加1%氯化金水溶液1~2毫升 如色调过深,可用下液处理 2%硫代硫酸钠水溶液10毫升,10%铁氰化钾水溶液10滴 流水冲洗10分钟。 可用伊红复染。 脱水,透明,封片。 结果:神经元胞体、突起、纤维黑色,纵行平滑肌淡灰色(伊红染色则为红色) 骨骼肌内神经纤维显示(略) Rager改良银染法(胚胎性神经组织) 组织固定于下液3~4天,脱水透明,石蜡包埋切片厚10~20微米 固定液:甲醛液5毫升,冰醋酸5毫升,80%酒精90毫升 切片粘片,烘干 甲苯脱蜡下行入水 1%铬酸(Chromic acid)水溶液10~30分钟 (37℃)或用1%重铬酸钾(Potassium dichromate)或5%甲醛pH7.4,0.1M磷酸缓冲液各2小时(37℃),蒸馏水洗15分钟 镀银染色16~24小时(37℃避光),水速洗 0.01%硝酸银0.1M硼酸硼砂缓冲液pH8 0.5%醋酸水溶液洗20分钟,换2次 还原5~10分钟至切片呈灰褐色,水洗 还原液: A.无水碳酸钠(Sodium carbonate)50克,蒸馏水1000毫升 B.硝酸银2克,无水矽钨(Silicotungstic acid)10克,蒸馏水1000毫升 C.甲醛7毫升,B液1000毫升 先将B液7毫升缓慢加入A液10毫升,随加随时振荡,再慢慢加入C液3毫升 0.5%醋酸水溶液5分钟终止还原,水洗 1%氯化金水溶液调色 脱水,透明,封片 结果:神经纤维黑色 Lowit氯化金甲酸浸染法 取新鲜眼球肌或鼠尾肌剪成小块,浸于蒸馏水稀释1~2倍的甲酸约10~20分钟至肌组织透明 入1%氯化金水溶液15~60分钟至肌组织呈黄色 移入蒸馏水稀释1~2倍甲酸液暗处24小时 入纯甲酸数小时至组织呈紫红色,蒸馏水洗 用分离针剪成小块,放在载玻片上,加盖玻片稍加压力使其分散。 结果:神经纤维和运动终板呈棕黑色 Ranvier氯化金甲酸法(运动终板、触觉小体) 取新鲜眼球肌或鼠尾肌剪成小块入下液约1小时,蒸馏水洗速洗 1%氯化金水溶液8毫升,甲酸(CP)2毫升,放入25毫升试管内,小火加温至煮沸立即停止。待溶液冷却后再加温,至煮沸立即停止,待溶液冷却后再加温。反复煮沸三次。若试剂不纯,产生 黑色沉淀,冷后将组织放入。 入蒸馏水稀释4倍的甲酸或冰醋酸水,放有光处还原24~48小时 浸于70%酒精2~4天 取出分离成小块,加甘油或甲酸甘油等量混合液1滴,加盖玻片稍加压力使肌纤维分散,镜下观察。浸染良好的标本,用漆将盖玻四周封闭,防止液体蒸发 结果:神经纤维、运动终板呈褐黑色,肌纤维紫红色或蓝紫色。 染触觉小体:在氯化金溶液浸2~4小时,还原后经酒精脱水,制成蜡块和切片。 Ranvier柠檬汁氯化金法 取小块肌组织入新榨的柠檬汁(用前过滤)约5~15分钟至组织透明,蒸馏水速洗 入1%氯化金水溶液20~30分钟,蒸馏水速洗 入1%冰醋酸水放有光处还原24~48小时,若制作永久保存的标本,用蒸馏水稀释1~2倍甲酸还原24小时 入5%硫代硫酸钠水溶液5~25分钟,自来水及蒸馏水洗 入纯甘油2小时换3次 取出分离成小块,加甘油或甲酸甘油等量混合液1滴,加盖玻片稍加压力使肌纤维分散 用冰醋酸水还原则可分离;制成永久性标本经各级酒精脱水,二甲苯透明,硬蜡包埋。 Rogers银浸法 甲醛或Bouin液固定:前者流水冲洗发小时;后者用70%酒精洗涤除去苦味酸 入80%酒精100毫升+氨水1毫升、90%酒精100毫升+氨水1毫升、95%酒精100毫升+氨水1毫升 各24小时 无水酒精脱水 氯仿或香柏油透明,石蜡包埋 切片4~40微米,蛋白甘油粘片 切片脱蜡,经无水酒精入含2%氨水的95%酒精12小时,80%酒精洗涤 入40%硝酸银水溶液暗处浸20分钟,蒸馏水速洗 20%甲醛2~5分钟 硝酸银液镜检至神经着色,蒸馏水洗1分钟;过深入4%冰醋酸水脱色 20%硝酸银水溶液4毫升,滴加氨水至沉淀恰好溶解,再加蒸馏水4毫升和氨水2滴。只能用一天 入0.33%氯化金50毫升+冰醋酸 10滴10~15分钟,蒸馏水洗 如过深则入4%草酸水溶液脱色 硫代硫酸钠5分钟,水洗 脱水 ,透明,封固 结果:轴索及神经终末 呈黑色 轴索也叫轴突,神经元的轴突和感觉神经元的长树突 Gladden(1970)吡啶银改良法(骨骼肌感觉神经及运动终板) 分离标本,完整显示运动终板结构 取大白鼠尾肌固定24小时 45%酒精50毫升,硝酸0.5毫升 入含氨水的无水酒精24小时,蒸馏水洗24小时 2%硝酸银水溶液25℃天 还原6~24小时,蒸馏水洗 还原液:5%甲酸水溶液100毫升,焦性没食子酸0.4克 浸于纯甘油内,制成分离标本,湿性封固剂封固 结果:骨骼肌淡黄色,运动终板及感觉神经末梢黑色 氯化金改变法(Ranvier) 取材:肌肉3毫米小块 运动终板、肌梭、腱梭——小白鼠肋间肌或腓肠肌 环层小体——幼猫肠系膜 固定:20%甲酸25分钟至半透明(或柠檬汁固定10~50分钟)或下液固定至半透明,肌组织及环层小体呈红紫色,神经纤维黑色 枸橼酸10~20克,葡萄糖5~7克,1%氯化金水溶液 100毫升 用干净的滤纸沾干组织 1%氯化金水溶液暗处浸15~60分钟至肌组织呈金黄色 直接投入25%甲酸8~12小时或20%甲酸1天(暗箱内),至组织呈红紫色,神经纤维呈黑色 换洗蒸馏水若干次,用滤纸沾干组织 浸入下液备检,可较长时间存放 中性甘油CP 10毫升,50%酒精 10毫升 取出组织,放在载玻片上,滴加少量甘油,用我轻拨组织,加盖玻片并轻压,镜检,如可用,用树胶加于盖玻片四周 结果:肌肉、环层小体、肌梭、腱梭呈红紫色;神经纤维黑色 (十) 染色体 Heidenhain铁苏木精染色法(染色体) 动物:营养良好的幼年小白鼠 固定:Regaud液4天,每天换新液;3%重铬酸钾水溶液铬化7天,流水冲洗1天 切片:厚3~4微米 染色: 常规脱蜡至蒸馏水 2.5%铁明矾液2~12小时,苏木精无水酒精溶液(5%)4~36小时,蒸馏水洗 苏木精液:苏木精0.5克溶于无水酒精10毫升加蒸馏水90毫升,4~6周后氧化成熟。用时以蒸馏水稀释一倍。也要苏木精中加碘酸钠0.1克助成熟 2.5%铁明矾液分色至线粒体呈深蓝至蓝黑色而其它组织无色 自来水洗,蒸馏水洗 酒精脱水,二甲苯透明,封固 结果:线粒体、中心体、染色体呈深蓝至蓝黑色 铁明矾含铁量11.58%,淡紫色结晶。新明矾液呈淡黄色,成黑黄绿色应换新液 用10%苏木精原液稀释稀释染色4~12小时 Regaud铁苏木精染色法(染色体) 材料:胰或小肠,薄块组织 固定:Regaud液,4天,每天换新液 3%重铬酸钾水溶液7天,隔天换一次新液 流水冲洗24小时 脱水、透明时间尽量短,或选用正丁醇等脱水兼透明剂 切片:3~5微米 染色: 5%铁明矾水溶液12~24小时,蒸馏水速洗两次 Weigert苏木精12~24小时,流水洗,蒸馏水洗 2.5%铁明矾水溶液分色至线粒体呈黑色、其它结构无色 流水冲洗5~30分钟 脱水 ,透明,树胶封片 结果:线粒体黑色,背景浅灰色或无色 (十一 )皮肤细胞间桥和张力原纤维 铁苏木精染色法 材料:人指皮 固定:Zenker液,脱汞 切片:6微米 染色: 2.5%铁明矾水溶液8小时,蒸馏水稍洗 Weigert苏木精液染色8小时,蒸馏水洗 1.25%铁明矾水溶液 分色,流水冲洗30分钟 伊红淡染 脱水 ,透明,封片 结果:细胞间桥、张成原纤维黑蓝色,背景淡红色 表皮棘层棘细胞体积大,多边形,细胞间桥清楚。经常受摩擦的皮肤,其棘细胞内张力原纤维特别丰富,细胞质内原纤维纵横交错。封片时,如表层卷翘,滴香柏油透明,以二甲苯 洗去香柏油,迅速封片 (十二) 横纹与闰盘 磷钨酸苏木精染色法 试剂: 磷钨酸苏木精:苏木精0.5克,磷钨酸5克,蒸馏水500毫升 苏木精溶于蒸馏水100毫升 磷钨酸溶于蒸馏水400毫升 二液混合,1~2个月可用。可用数年 材料:骨骼肌——膈肌、舌肌;心肌 固定:Zenker液、Helly液 切片:6微米 染色: 脱蜡下行至70%酒精,入碘酒精脱汞,硫代硫酸钠去碘,水洗 甲醛固定 的组织:10%盐酸酒精溶液-3%重铬酸钾水溶液等量混合液30分钟 氧化:入氧化液1分钟或0.25%高锰酸钾水溶液5分钟,水洗 氧化液:0.5%高锰酸钾水溶液100毫升,3%硫酸水溶液5毫升 漂白:1%草酸水溶液5~20分钟,流水冲洗1~2分钟 染色:磷钨酸苏木精染12~24小时 直接入95%酒精快速分色至适度 无水酒精或丙酮及无水酒精二甲苯等量混合液脱水 二甲苯透明,封片 结果:肌组织蓝色;骨骼肌横纹特别清晰;肌上皮细胞蓝色;胶原纤维紫红色;红细胞蓝色 (十三 ) 碳水化合物 PAS(过碘酸Shiff试剂反应)(碳水化合物) 材料:肝、心肌、骨骼肌;毛囊、子宫腺、阴道上皮、脐带、中性粒细胞等;(细胞质) 固定剂:Carnoy液,Rossman液,80%以上酒精等;AFA,Gendre液 Rossman液(苦味酸无水酒精饱和液90毫升,中性甲醛10毫升)固定,95%酒精洗几日;无水酒精脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,切片6~8微米。 对照片:已知含糖原切片在1%淀粉酶(Amylase)液处理1小时(37 ℃),水洗;同时作糖原染色 方法: 石蜡切片脱蜡经酒精下行至水(包括对照) 1%过碘酸(Periodic acid)水溶液2~5分钟,蒸馏水洗数次 Schiff试剂8~10分钟,流水冲洗5~10分钟 苏木精浅染细胞核,水洗 脱水,透明,封片 结果:糖原及其它PAS阳性物质呈品红色,淀粉酶处理的对照片为无色,细胞核蓝色 Best染色法(糖原) 试剂: 卡红液:卡红原液15毫升,氨水12.5毫升,甲醇12.5毫升 卡红原液:卡红(Carmine)3克,无水碳酸钾(Potassium carbonate)1克,氯化钾(Potassium chloride)5克,蒸馏水60毫升 置大烧瓶内文火煮沸,冷后加入氨水30毫升,充分摇荡,过滤,保存于有色瓶,保存于冰箱(4℃),可用数月 Best分色液:甲醇40毫升,无水酒精80毫升,蒸馏水100毫升 方法: 石蜡切片脱蜡下行至蒸馏水 苏木精染核,盐酸酒精分色至背景无色 卡红液染5~15分钟 分色液内充分分色 用新鲜95%酒精洗涤 无水酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片 结果:糖原鲜深红色;黏蛋白、纤维蛋白浅红色;细胞核蓝色 (十四) 肾脏肾小球基底膜 六胺银染色法(尿酸盐) 切片脱蜡至无水酒精 直接入六胺银液(37℃)15~60分钟呈黑色尿酸结晶 六胺银液:3%六胺银水溶液100毫升,5%硝酸银水溶液5毫升 工作液:六胺银原液30毫升,硼砂-硼酸缓冲液(pH7.8)8毫升 硼酸硼砂缓冲液(pH7.8):0.2M硼酸16毫升,0.05M硼砂4毫升 5%硫代硫酸钠水溶液3分钟 0.1~0.5%伊红酒精溶液1分钟 脱水,透明,封固 结果:尿酸盐黑色,钙盐沉淀黑色 六胺银染色法(肾小球基底膜) 固定:Bouin液,10%甲醛液 切片:3微米 0.5%高碘酸氧化15分钟,流水冲洗5分钟 8%铬酸氧化30分钟,流水稍洗 1%偏重亚硫酸钠1分钟,流水冲洗5分钟,蒸馏水洗 预热60℃六胺银液60℃恒温箱30~60分钟直到切片在黄色背景下见到黑色反应,取出切片镜检,肾小球毛细血管基底膜出现黑色银沉淀;蒸馏水稍洗 0.1%氯化金水溶液2分钟,蒸馏水稍洗 3%硫代硫酸钠3分钟,自来水冲洗5分钟 苏木精伊红浅染 各级酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片 结果:肾小囊基底膜和肾毛细血管基底膜黑色;霉菌、弹性纤维及一些网状纤维黑色;细胞核蓝色;细胞质红色。 (十五)球旁细胞 球旁细胞是位于入球小动脉处血管中膜上皮样的平滑肌细胞,细胞质内有细小颗粒,细胞核圈套,圆形或卵圆形,染色质较少 Harada结晶紫染色法(球旁细胞) 用小白鼠、大白鼠、胎儿或鸟类肾脏容易得到满意效果 材料:幼年小白鼠肾组织 固定:Susa液,Helly液 染色:切片常规脱蜡至水 0.1~0.5%结晶紫(Crystal violet)等水溶液或70%酒精溶液3分钟 0.01N盐酸分色1分钟,蒸馏水洗 苯胺油二甲苯等量混合液分色至球旁细胞呈紫色 二甲苯两次洗去苯胺油 封片 结果:球旁细胞颗粒呈紫红色 改用10%甲醛100毫升加重铬酸钾5克和冰醋酸2.5毫升混合液固定,丙酮二甲苯等量混合液分色,结果相同。可用乙基紫(Ethyl Violet)、甲基紫、新品红(New Fuchsum)、胜利蓝4R(Victoria blue 4R)等染色 (十六) 核酸 甲基绿-派洛宁染色(DNA和RNA) 2%甲基绿水溶液:甲基绿(Methyl green)1克,蒸馏水50毫升,用三氯甲烷抽提 5%派洛宁水溶液:派洛宁G(Pyronine G)1克加蒸馏水至20毫升 0.2M醋酸盐缓冲液(pH4.8):0.2醋酸水溶液41毫升,0.2M醋酸钠水溶液59毫升 甲基绿派洛宁液:2%甲基绿水溶液5毫升,5%洛宁水溶液1毫升,蒸馏水12毫升,02M醋酸盐缓冲液(pH4.8)18毫升 甲基绿提取法:2%甲基绿水溶液20毫升倾入洁净分液漏斗,加氯仿20毫升充分摇荡混合,甲基紫溶于氯仿而呈紫红色。旋动分液漏斗下部的砂塞,慢慢把下面紫红色的氯仿移去,再加入新的氯仿10毫升。反复数次。直到氯仿无紫红色为止。 方法: 新鲜组织固定于Carnoy液(4C)3~6小时,95%酒精和无水酒精脱水 ,二甲苯透明,石蜡包埋。 二甲苯脱蜡至水 甲基绿派洛宁液室温30~60分钟,用滤纸吸干 多余染液 丙酮迅速分化。 丙酮二甲苯(1:1)稍洗 二甲苯透明2~3次 中性树胶封片 结果:RNA(胞质内和核仁内)红紫色,DNA(核染色质)绿色或绿蓝色 对照片:阴性 取另一连续切片用核糖核酸酶(Ribonuclease)1毫克/毫升于37℃温箱消化3小时,蒸馏水洗洗,甲基绿派洛宁染色,结果阳性 切片在10%高氯酸(Perchloric acid)4C12~18小时,水洗,1%碳酸钠2分钟,流水冲洗5分钟,蒸馏水洗,甲基绿派洛宁染色,结果阴性 (十七)植物学标本制作 1 固定液: ⑴酒精甲醛醋酸液(AFA,AAF):50~70%酒精90毫升,甲醇5毫升,冰醋酸5毫升,加甘油5毫升防止液体挥发和组织变硬 坚硬的组织用70%酒精,固定24小时后用70%酒精 洗几次,从70%酒精脱水 柔软易碎的组织用50%酒精,固定24小时后用50%酒精洗几次,从50~70%酒精脱水 酒精醋酸固定液: ⑵Carnoy液:无水酒精15毫升,冰醋酸5毫升;无水酒精30毫升,冰醋酸5毫升,氯仿15毫升 根尖固定15~20分钟,花药1小时,动物组织1.5~3小时,不超过1天。固定后用无水酒精洗2~3次至组织不含冰醋酸和氯仿,可很快透明,必须更换保存液保存 ⑶酒精醋酸液:95%酒精1~3份,冰醋酸1份 固定动植物组织和细胞2~24小时,用95%酒精脱水 铬酸醋酸固定液 液体不少于组织25倍,固定24~48小时,可放几天但不能太久。脱水前流水彻底洗净铬酸 ⑷弱型铬酸醋酸液:10%铬酸水溶液2.5毫升,10%醋酸水溶液5毫升,蒸馏水92.5毫升 用于易渗透的材料如藻类、菌类及苔藓、蕨类的原叶体、孢子囊等 ⑸中型铬酸醋酸液:10%铬酸水溶液7毫升,10%醋酸水溶液10毫升,蒸馏水83毫升 固定幼嫩组织如根尖、茎尖、子房、脑磷脂珠等 ⑹强型铬酸醋酸液:10%铬酸水溶液10毫升,10%醋酸水溶液10毫升,蒸馏水100毫升 常用于木质材料和坚韧的叶子。用时2%麦芽糖或尿素或5%皂素,有利于液体渗透 铬酸醋酸甲醛固定液——纳瓦兴液(Nawashin’s solution,1912) 细胞学和胚胎学最常用,效果十分良好,尤其是涂抹小孢子的材料如花药及根尖部很适合 可用Carnoy液固定5~10分钟,再用纳瓦兴液固定,如某些材料外部密被绒毛,如小麦的子房、芽等 ⑺Randoph液:比纳瓦兴原液更佳,对于根尖、花药、子房等固定效果理想,尤其对细胞有丝分裂,能显示染色体、纺锤丝。 甲液:铬酸1.5克,冰醋酸10毫升,蒸馏水90毫升 乙液:甲醛40毫升,蒸馏水60毫升 用时等量混合,固定12~48小时,液体为暗绿色失效。固定后用水或70%酒精冲洗两次即可脱水 ⑻Belling液: 甲液:铬酸5克,冰醋酸50毫升,蒸馏水320毫升 乙液:甲醛200毫升,蒸馏水175毫升,皂素3克 固定细胞分裂中期及后期分裂的涂片,将乙液中的甲醛改为100毫升,蒸馏水改为275毫升,固定3小时,固定后将涂片入0.5%铬酸水溶液几分钟,除去甲醛再染色 2 脱水 酒精:从30%甚至10%酒精开始,低浓度快些,高浓度慢些,经10%酒精、30~35%酒精 、50%酒精~60%、70%酒精、80~85%酒精、90%酒精、95%酒精 和无水酒精 3 透明 二甲苯:无水酒精-二甲苯(2:1),无水酒精二甲苯等量混合液,无水酒精二甲苯(1:2),二甲苯,二甲苯,1~3小时 冬青油(冬绿油):植物维管系统 4 浸蜡和包埋 加石蜡于二甲苯至饱和,二甲苯石蜡(1:1),软蜡+蜂蜡(5或9:1),硬蜡+蜂蜡 脑组织浸蜡时间应稍长 5 切片 蜡片蜷曲:切片刀(片)不锋利;角落不对;切片太薄或太厚;石蜡太软或太硬;组织不在蜡块中心 蜡与组织分离:包埋时石蜡温度与组织温度不一致 蜡片上有条纹:切片刀上有缺口 蜡带不成直线:蜡块上下不平行 蜡片破碎而吸附在切片预选上:材料过脆、与刀口产生 静电效应 6 染色 番红:染木化、角化、栓化细胞壁,染色体、核仁、中心体等2~24小时为红色。常与固绿、亮绿、苯胺蓝双重染色,与结晶紫、橘黄G三重染色 番红(Safranin)1克,50%或95%酒精100毫升 Heidenhain苏木精:染色体、蛋白质核(淀粉核)、线粒体等,可与番红或伊红作双重染色 甲液:2~4%硫酸铁铵水溶液暗处数日用时配 乙液:0.5%苏木精水溶液大烧杯内,用纱布盖严,阳光下,每日搅拌几次至呈深红色,过滤。或苏木精10克溶于无水酒精100毫升,氧化成熟,用时取4~5毫升加蒸馏水100毫升 Delafield苏木精:纤维素的细胞壁,染色质和造孢细胞。可与伊红80%酒精溶液双重染色。 硫酸铝铵溶于蒸馏水100毫升至饱和;溶苏木精1克于无水酒精10毫升。相混,广口瓶,纱布盖住口,置空气中一周,过滤,加甘油25毫升和甲醇25毫升,至两月左右颜色呈葡萄酒状。 卡红(洋红Carmine):能把整块材料着色,对幼嫩小型材料如花粉母细胞等,染色后直接用甘油明胶或糖浆封固,非常适于涂抹制片。使细胞核染成深红色,细胞质呈浅红色,长久保存不褪色。 铁明矾醋酸卡红:卡红1克溶于煮沸的45%醋酸100毫升,冷后过滤,再加4%铁明矾水溶液1~·滴,过几小时使用 临时染色和涂抹制片均适用,观察小麦花粉粒形成,染色体、细胞核十分清楚,染成深红色,细胞质浅红色,也可用于洋葱根尖及其鳞茎表皮细胞染色 地衣红(Orcein):花粉母细胞及根尖等固定染色,细胞质着色较浅,效果比卡红好。 地衣红1克溶于45%醋酸100毫升,加热搅拌至沸腾,离火,继续加热5~10分钟,冷却后过滤。 结晶紫(Crystal violet):染细胞核、细胞质、纺锤丝和鞭毛等呈紫色。与番红双重染色可染真菌的菌丝体和子实体;与番红、橘黄G三重染色 1%结晶紫水溶液:结晶紫1克,蒸馏水100毫升 结晶紫1克,95%酒精100毫升 结晶紫0.5克,无水酒精或丁香油100毫升 染色前入5%高锰酸钾水溶液5分钟,或染色后入碘液(碘1克,碘钾2克,蒸馏水300毫升)效果较好 亮绿(Light green) 可与番红或玫瑰红(Phloxine)双重染色1~50分钟,盐酸酒精退色,95%酒精 洗净,90%、80%、70%、60%酒精几分钟,再染番红,脱水至95%酒精再染亮绿。木质化细胞壁染成红色,纤维素细胞壁染成绿色,纺锤丝染成绿色 亮绿0.2克溶于95%酒精 亮绿1克溶于丁香油100毫升 亮绿1克溶于丁香油15毫升,无水酒精25毫升 固绿或快绿(Faft green):染色方法、染色时间及配制与亮绿相同,不易褪色,染色时间很短。 染色剂选择 全部染色 俾士麦棕、卡红、卡红酸、Harris苏木精 纤维素细胞壁:酸性品红、苯胺蓝、俾士麦棕、刚果红、Delafield苏木精、结晶紫、真曙红、甲基紫、固绿、亮绿、甲基绿、亚甲基蓝、亚甲基绿、碱性品红 角化细胞壁:酸性品红、结晶紫、真曙红、甲基绿、甲基蓝、番红O 木化细胞壁:结晶紫、甲基绿、亚甲基绿、番红O 角质:番红O 细胞质:酸性品红、苯胺蓝、真曙红、固绿、靛青卡红、橘黄G、刚果红 细胞核:卡红、结晶紫、甲基紫、碱性品红、Heidenhain苏木精,番红O,甲基绿,甲基蓝 中层:Heidenhain苏木精,钌红 栓化细胞壁:番红O,苏丹Ⅲ,苏丹Ⅳ 筛板塞:苯胺蓝 植物胶质:俾士麦棕,刚果红非色素部分:苯胺蓝,真曙红,固绿,甲基紫,结晶紫 分裂时的染色体:巴西木素,卡红,卡红酸,苏木精,结晶紫,茜素红S,甲基紫,甲基绿 脂肪:苏丹Ⅲ,苏丹Ⅳ 线粒体:苏木精,酸性品红,结晶紫,甲基紫 质体:结晶紫,甲基紫,Heidenhain苏木精 染色体:巴西木素,卡红,卡红酸,苏木精,甲基绿,番红 后含物:酸性品红,结晶紫,Heidenhain苏木精,Janus绿 番红固绿双重染色法 取材固定于FAA或AFA或AAF液24小时 50%酒精 洗2次(铬酸或Nawashin液固定则水洗) 脱水:70%酒精→80%酒精→90%酒精→95%酒精(加少量番红)→无水酒精2次,加30~60分钟 透明:二甲苯2~3次,每次30~45分钟 浸蜡:室温(20~30℃)至饱和,二甲苯石蜡等量混合液,纯石蜡液,各30~60分钟 包埋,切片(8~15微米),粘片(35~45℃),烤片 二甲苯脱蜡2~3次约5~15分钟,经各级酒精下行至水,每级不超过1分钟。 0.5%番红50%酒精溶液染色6~12小时 50%酒精洗去多余染料 70%酒精、80%酒精、90%酒精、95%酒精脱水各1分钟 0.5%固绿95%酒精溶液染色1分钟左右 95%酒精 分色或用盐酸酒精分色 无水酒精脱水2~3次各2分钟,二甲苯2~3次各2~3分钟,树胶封固 番红结晶紫橘黄G三重染色法 染细胞分裂的材料最佳,如根尖、茎尖的细胞分裂等切片,可见红色的染色体、紫色的纺锤丝及橘红色的细胞质,宜用Nawashin液或铬酸醋酸固定液固定 切片脱蜡至50%酒精 1%番红50%酒精溶液6~12小时 50%酒精洗去多余染料 逐级脱水至90%酒精 1%结晶紫90%酒精溶液1分钟 90%酒精分色,脱水至无水酒精 1%橘黄G丁香油溶液滴染并分色30~60秒至紫色渗出无水酒精1分钟 透明,封片。 (十八)马蛔虫卵细胞分裂标本制作 取活的雌马蛔虫,用0.9%生理盐水洗去虫体的污物,沿虫体背部中线解剖,在阴道与子宫连接处及子宫输卵管连结处用细线各做一结扎,把两条子宫连同阴道一并取下,再把子宫分成前后两大段,每大段用细线结扎成无数约5厘米长的小段,每小段两端用线结扎,防止虫卵从子宫脱出,分别用两只广口瓶盛装前段和后段进行固定。 子宫 近阴道段是生殖细胞成熟分裂和受精的部位,可直接将子宫上段浸放固定液固定;子宫后段浸下液,固定子宫并能刺激受精卵分裂。 固定液:甲醛5毫升,冰醋酸5毫升,95%酒精80毫升,甘油10毫升 后段置30℃下4小时,虫卵开始分裂,2~4小时分裂一次,5~8小时可提供各个时期的细胞分裂的卵,按时分批入固定液固定。 固定:把大段标本沿结扎线切成许多小段,使每小段均有线结扎,浸入下液固定。 固定液:(临时配制)无水酒精1份,冰醋酸 1份,氯仿1份,升汞加至饱和 浸洗、脱水:95%酒精 浸洗几次,生平我加入几滴碘酒浸4~12小时除去水分,无水酒精两次脱水各2~4小时 透明:用氯仿逐滴加入浸有材料的无水酒精中,最后将材料浸入氯仿里 包埋、切片:室温下将石蜡慢慢加入浸有材料的氯仿中达到饱和;低熔点石蜡浸蜡4小时。 将包埋的材料作横切或纵切,厚度6~8微米,展片,贴片,烤片,脱蜡,Heidenhain铁苏木精染色2小时,经酒精脱水,无水酒精二甲苯等量混合液、二甲苯透明,树胶封固。 (十九)卵巢门细胞
第五部分 非切片染色法(涂片、抹片、爬片) 一、血液和骨髓 玻片清洁处理:先用洗衣粉或皂角水煮,清水洗净;清洁液浸泡;流水充分冲洗;70%或95%酒精拭净。载玻片洁净无痕 DPX封固剂:(有现成试剂出售) 二甲苯40毫升,磷酸甲苯(tricresyl phosphate)或磷酸三甲酚7.5毫升,迪士春10毫升 瑞氏染色法(血细胞) Wright染料 0.5%碳酸氢钠100毫升,美蓝(次甲基蓝)1克,加温煮沸约1小时,冷却,过滤。取滤液100毫升,加0.5%伊红水溶液500毫升,混匀,过滤,将沉淀烤干,即为Wright染料粉末,研细备用 Wright液: Wright粉剂0.1克,甲醇60毫升 将粉剂放在研钵中,充分研磨。逐渐加甲醇,边加边磨,直到粉剂全部溶解,试剂瓶密封保存,1周后使用 ,1个月后最好 方法 涂片滴加Wright液至血膜染色2分钟 加等量M/15磷酸盐缓冲液( pH7)或中性蒸馏水染3分钟 蒸馏水洗至血膜呈淡红色 立干或甩干 (镜检) 二甲苯透明,中性树胶或香柏油透明,封片 结果: 红细胞,橘红色; 中性粒细胞,颗粒蓝紫至紫色红色; 嗜酸性粒细胞,颗粒鲜红色至橘红色; 嗜碱性粒细胞,颗粒深蓝紫色; 淋巴细胞,核深蓝紫色,胞质天蓝色; 单核细胞,核蓝紫色,胞质灰蓝色 注意: Wright染料对pH较敏感,用缓冲液稀释或中性蒸馏水可使染色作用稳定; 红细胞呈紫红色,染色时间长。白细胞核为天蓝色,染色时间过短; 染色过程中保持组织湿润,否则会产生沉淀; Wright液应密封保存,吸水后染色佳。 姬姆莎染色法(血细胞) Giemsa染料: 天青Ⅱ伊红0.6克,天青Ⅱ0.16克,甘油50毫升,甲醇50毫升将甲醇加温至60℃,将染料加入甲醇溶解,慢慢加入甘油(加温至60℃)混匀,37℃温箱12小时,过滤备用 Giemsa液 Giemsa粉剂0.8克,甘油50毫升,甲醇50毫升 将粉剂溶于甲醇,在研钵充分研磨溶解,加入甘油,混匀,37℃温箱8~12小时,棕色瓶密封保存 Giemsa稀释液: 原液5毫升,M/15磷酸盐缓冲液(pH6.4~6.8)50毫升 方法: 涂片晾干用甲醇固定2~3分钟 入Giemsa稀释液染15~30分钟或更长(冬天37℃温箱) 磷酸盐缓冲液分色镜检,着色分明清晰 晾干,用香柏油或DPX封片 结果:红细胞,橘红色; 中性粒细胞,核蓝色,颗粒紫色; 嗜酸性粒细胞,核蓝色,颗粒红色; 嗜碱性粒细胞,核暗蓝色,颗粒暗紫红色 Wright-Giemsa混合染色法 涂片用甲醇固定2~5分钟,晾干 混合液加等量蒸馏水或磷酸盐缓冲液染色5~10分钟 Wright-Giemsa混合液:Wright液1毫升,双蒸水或磷酸盐缓冲液(pH6.4~6.98)6毫升,无沉淀 蒸馏水速洗,晾干 95%酒精分色10~30秒 无水酒精脱水10~30秒 二甲苯透明 香柏油或DPX封片 二、细菌、霉菌和真菌 Gram苯胺结晶紫染色法(细菌) 试剂: 1%伊红水溶液:伊红Y(Eosin Y) 1克,加蒸馏水至100毫升 苯胺结晶紫液:结晶紫(Crystal violet)2克溶于无水酒精10毫升;苯胺(Ailine)2毫升与蒸馏水88毫升混匀,过滤;二者混合。用前过滤。可用数月 Weigert碘液:碘片(Iodine)1克,碘化钾(Potassium iodide)2克,蒸馏水100毫升 苯胺二甲苯:苯胺-二甲苯(1:1) 方法: 固定:10%甲醛液 明矾苏木精染核,流水洗10分钟 1%伊红液56℃温箱10分钟,水稍洗 用滤纸将苯胺结晶紫液滴在切片上染色10分钟 倾去染液,用滤纸吸干周围染液 苯胺二甲苯分化切片,轻摇至无颜色溢出 立即倾去苯胺二甲苯 滴入二甲苯 除去苯胺,镜下至切片清晰显示 二甲苯多次洗切片 中性树胶封固 结果:革兰氏阳性菌蓝紫色,细胞核 蓝黑色,其他组织粉 红色 Gram法 切片脱蜡至水 2.5%伊红水溶液10分钟,水稍洗 1%甲基紫水溶液3分钟,水洗 碘液3分钟 倾去碘液,用滤纸吸干 二甲苯洗,封固 结果:纤维素蓝黑色,其它红色 PAS法 亮绿水溶液:亮绿(Light green FCF)0.2克,蒸馏水100毫升,冰醋酸0.2毫升 固定:10%甲醛水溶液 切片脱蜡至水 0.5%过碘酸液5~10分钟,流水洗2分钟,蒸馏水洗 Schiff试剂暗处加盖10~20分钟 0.5%偏重亚硫酸钠(焦亚硫酸钠Sodium metabisulfite)水溶液滴洗2次各1分钟,流水冲洗5分钟 亮绿水溶液复染数秒,水稍洗 常规脱水,失明,中性树胶封片 结果:霉菌品红色,其他组织绿色 改良Gomori六胺银法 试剂: 8%铬酸(Chromic acid)8克溶于蒸馏水100毫升 0.5%偏重亚硫酸钠水溶液 5%硝酸银水溶液 硝酸银(Silver nitrate)0.25克,蒸馏水5毫升 3%六次甲基四胺水溶液:六次甲基四胺(乌洛托品Methenamine,Hexanmethylenetetramine)3克溶于蒸馏水100毫升 5%四硼酸钠水溶液:四硼酸钠(硼砂Sodium tetraborate)5克,蒸馏水100毫升 六胺银贮存液:5%硝酸银水溶液5毫升,3%六次甲基四胺水溶液100毫升,摇动中溶解,澄清液保存于4C冰箱,可用数月 六胺银工作液:5%四硼酸钠水溶液2毫升与蒸馏水20毫升混合,加贮存液10毫升,搅拌混匀 1%氯化金水溶液:氯化金(Gold chloride)1克溶于蒸馏水100毫升。用时用蒸馏水按1:9稀释为0.1%氯化金水溶液 2%硫代硫酸钠水溶液:硫代硫酸钠(Sodium thiosulfate)2克溶于蒸馏水100毫升 亮绿水溶液:亮绿(Light green)0.2克溶于蒸馏水100毫升,冰醋酸(Glacial acetic acid)0.2毫升 橙黄G液:橙黄G (Orange G)2克溶于蒸馏水100毫升,加磷钨酸(Phosphotungstic acid)5克 方法: 固定:10%甲醛 切片脱蜡至水 铬酸液20分钟,水稍洗 偏重亚硫酸钠液1分钟 流水5分钟,蒸馏水2次 六胺银液(58~60℃)60~90分钟至切片呈黄褐色,霉菌呈黑褐色;蒸馏水洗 氯化金调色2~3分钟,流水稍洗 硫代硫酸钠液2~5分钟,流水冲洗5分钟 亮绿液20~40秒或橙黄G液1~2秒,水速洗 95%酒精 和无水酒精脱水 二甲苯透明,中性树胶封片 结果:霉菌菌丝孢子呈明显黑褐色;抗酸菌呈黑褐色;背景淡绿色(亮绿)或橙黄色(橙黄G)或红色(伊红复染) 三、细胞爬片 苏木精伊红染色法 固定液:95%乙醇和冰丙酮 苏木精染液:苏木精0.5克溶解于蒸馏水70毫升中,加铵明矾24克,溶解后取加碘酸钠1克,水5毫升,甘油30毫升和冰醋酸2毫升,混合均匀,滤纸过滤,备用。 伊红染液:称取水溶性伊红0.5克,溶于蒸馏水100毫升中。 盐酸酒精:1%盐酸75%酒精溶液 方法: 对于贴壁生长细胞,胰酶消化,调整细胞浓度约1×105/ml,滴加于盖玻片上(置于6孔板中),培养相应时间后,取出细胞爬片,用PBS洗涤3次。 固定:95%酒精固定20分钟,PBS洗涤2次,每次1分钟。 染色:过滤的苏木精染色2~3分钟,自来水洗涤。 用1%盐酸酒精溶液分色数秒,自来水洗涤。 伊红染液染色1分钟,自来水洗涤。 封片:吹干或自然晾干,二甲苯透明,中性树胶封片。 若用4%多聚甲醛固定,则染色时间相应延长,苏木精染色15~20分钟,伊红5分钟。
2021.10.30 2022.5.15修改(Zunyi)
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