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转自 简书 程凉皮儿 瑞典皇家理工学院基因技术系主任Joakim Lundeberg教授带领团队提出了一种分子方法，揭示了在胚胎心脏的三个发育阶段细胞类型的综合转录图谱，并将细胞类型特异性基因表达映射到特定的解剖结构域。该项工作以“A Spatiotemporal Organ-Wide Gene Expression and Cell Atlas of the Developing Human Heart”为题发表在《Cell》上杂志。 此文总结为一句话：利用空间转录方法在单细胞分辨率下探索人类心脏发育的基因表达图景，以构建一个3D器官范围的图谱。 Highlights
前言心脏是人类胚胎中第一个具有功能的实体器官。它起源于中胚层，并发展成心管，在受孕21天左右开始跳动(Sylva et al., 2014; Meilhac and Buckingham, 2018)。然后心管形成环状，大约30天后形成四个单独的心腔(即左右心房和左右心室)和心外膜。随后，流出道(OFT)分化，心室肌的外部转变为致密心肌和间隔。最终，OFT分裂成主动脉和肺动脉，大多数心脏隔室在怀孕前三个月末就完成了。这些复杂的事件是错综复杂和时空特异性的基因表达相互作用的结果，这些基因表达相互作用与心脏发育中的每个部分的空间和功能过程有关。 单细胞RNA测序(scRNA-seq)技术的快速发展使得单细胞转录图谱能够用来探索心脏内细胞的异质性，促进了我们对心脏分化过程的了解。例如，对胚胎(De�Laughter et al., 2016; Li et al., 2016; Lescroart et al., 2018)和成年(Gladka et al., 201)小鼠心脏的研究提供了使用组织匀浆无法获得的细胞特异性发现。此外，对心肌细胞空间位置的先验知识对于揭示胚胎小鼠心脏中特定的腔室基因和不同的时空心肌细胞群是关键的(DeLaughter et al., 2016; Li et al., 2016)。然而，小鼠和人类心脏发育之间存在差异；时间scRNA-seq研究揭示了人类特有的基因在发育过程中表达(Cui et al., 2019)，并且对分化很重要(Sahara et al., 2019)。 考虑到人类心脏发育的复杂性和不完全理解，我们认为建立一种能够同时分析心脏基因空间表达模式和细胞异质性的分子方法是很重要的。我们假设可以利用空间转录学(ST)(Sta˚ hl et al., 2016; Sal�me´ n et al., 2018), scRNA-seq (Zheng et al., 2017)和原位测序 (ISS) (Ke et al., 2013; Qian et al., 2019)开发出这样的方法。ST是一种非靶向技术，它使用条形码寡核苷酸阵列和标准组织学明场成像来确定组织切片中多聚腺苷酸转录本的定量空间分布。它生成数据驱动的空间地图并具有广泛的适用性(Giacomello et al., 2017; Giacomello and Lundeberg, 2018; Lundmark et al., 2018)。此外，它已被用于分析器官，包括大脑(Sta˚hl et al., 2016; Salme´ n et al., 2018)和成年人心脏(Asp et al., 2017)，以及神经变性(Maniatis et al., 2019)。相反，ISS是一种有针对性的方法，它在组织切片中使用挂锁探针和滚动圆圈扩增来针对已知基因(Ke et al., 2013; Qian et al., 2019)。它便于亚细胞分辨率的分析，以确认基于ST和scRNA-seq的区域标记和细胞类型识别。 在这里，我们描绘了一个时空图谱，它系统地描述了人类心脏在早期三个发育阶段的空间原型和细胞异质性：4.5-5，6.5和9个受孕后周(PCW)(图1)。我们通过利用ST的空间探索能力、scRNA-seq的去卷积能力和ISS的亚细胞靶向准确性创建了这个资源。最后，我们通过整合空间信息来可视化我们的结果，以生成三维(3D)转录地图。
图1 结果人类心脏发育过程中基因的时空动态表达我们最初通过免疫组织化学(IHC)染色从4.5-5、6.5和9PCW收集的人类胚胎心脏样本获得了人类心脏发育的时空概况(图2A-2C)。结果表明，左、右心室游离壁和间隔、左、右心房(TNNT2)在各时间点均由致密的小梁状心室肌组成。平滑肌肌动蛋白(ACTA2)染色显示4.5~5PCW心脏主动脉和肺动脉已开始形成，6.5和9个PCW心脏已提前形成主动脉和肺动脉。DAPI(4，6-二氨基-2-苯基吲哚)染色显示，在所有三个时间点，心外膜边缘都很薄。然而，房室(AV)心外膜下间充质(ACTA2)仅在6.5和9PCW时才在房室沟的上端可见，最后，在心包腔末端，即大动脉进入纵隔的地方，我们观察到相当数量的带肺静脉的纵隔组织(ACTA2)，这只在6.5和9PCW的心脏中才能看到，而ACTA2只在6.5和9PCW的心脏中才能看到，最后在心包腔的末端，大动脉进入纵隔，我们观察到相当数量的带有肺静脉的纵隔组织(ACTA2)，只有在6.5和9PCW的心脏中才能看到ACTA2。总之，IHC染色清楚地揭示了人类心脏发育过程中的时空蛋白表达模式。然而，分析受到一组预先选择的抗体的使用的限制。 为了不偏不倚地扩展我们的研究，我们使用ST来探索人类心脏发育过程中的全球时空基因表达动态。具体地说，我们沿着背腹轴分别从4.5-5、6.5和9个PCW心脏组织收集了4、9和6个组织切片(图S1A；表S1A)。联合数据集由总共3,115个单独的点(即，相当于包含以下内容的显微解剖的数据点)组成。每个单元30个(图S1L-S1O)，平均1700个基因和过滤后3,800个唯一的转录本(图S1B和S1C)。我们通过确定皮尔逊相关性来检查技术重复之间的相似性，发现所有时间点在基因表达水平方面都是可比较的(图S1D-S1G)。为了研究三个时间点之间的生物学差异，我们计算了样本之间的基因表达相关性，发现所有发育阶段的整体基因表达模式非常相似(图S1H-S1J)。然后，我们对所有三个阶段的联合空间(SPOT)基因表达谱进行降维和聚类。我们确定了10个时空保守的簇(图2D)，并将聚集点映射回其在组织切片中的原始坐标。引人注目的是，这些簇对应于所有三个心脏中定义的解剖区域(图2E-2G；参见数据S1：https://data./datasets/zkzvyprd5z/draft?a=c3021f62-a7af-4824-b89d-d7fbfec67902)。主要心肌区域(0、1、2、3和4簇)在所有时间点上都是共享的，并且似乎反映了心脏的生长，因为这些簇中的斑点数量随着年龄的增长而增加(图S1K)。与其他两个年龄组相比，4.5-5岁的PCW组织中OFT和较大血管(第5簇)的表达较低，主要由房室间充质(第6簇)代表。此外，含有血液和免疫细胞的空洞(第8簇)仅由6.5个PCW组织中的斑点表示，该组织比其他两个心脏含有更多的血液(见STAR方法)。 我们进行了解剖区域之间的差异基因表达(DGE)分析(图2H；表S2)和每个簇上调基因的基因集富集分析(图S2A)。与肌肉收缩和发育相关的基因本体(GO)特征在所有心肌簇(0、1、2、3和4)中都被检测到，而致密心肌(簇0)的代谢丰富。这三个小梁簇(1、2和3)可以通过它们在传导(簇1和簇2)和氧化代谢(簇3)方面的富集来区分(图S2A)。此外，2簇显示了MB和NPPA的差异表达(图2H)，这与氧转运和内分泌活性增强有关(Lin et al., 1990)。因此，不同的小梁心肌簇可能对应于小梁的不同成分，如与壁相关的、乳头肌或浦肯野纤维。心房心肌(簇4)也显示NPPA(内分泌活性)的差异表达(图2H)，以及与传导和心率调节相关的基因(图S2A)。另一方面，OFT、房室和纵隔间充质，以及心外膜(第5、6、7和9簇)表现出相似的GO特征，它们与细胞外基质相关，并具有不同程度的血管和动脉形态发生。簇5、6和7也丰富了与心脏瓣膜和间隔发育相关的特征(图S2A)。簇9显示了心外膜标志物ALDH1A2(Moss et al., 1998)、LRP2和ITLN1以及心外膜和心外膜衍生细胞(EPDC)标志物TBX18的表达(Cai et al., 2008; Wu et al., 2013)(图2H；表S2)。对OFT簇(簇5)的更深入研究发现，主要在发育后期(6.5和9PCW)的样本中检测到了OFT簇，显示成纤维细胞相关的细胞外基质基因表达丰富(如ELN、SPARC和OGN)和平滑肌相关基因如ACTA2和MYH11的表达(图2H)。这些标记物在早期4.5-5PCW组织的房室间充质远端的表达要弱得多(图S2B)，这意味着当OFT从房室间充质生长出来时，它的肌化和较大血管的形成开始在更远的地方发展，在那里可以发现心脏神经嵴细胞。
图S2 总而言之，这些结果表明，在所研究的时间窗口(4.5-9 PCW)内，空间基因表达在胚胎发育早期建立并一直保持，心脏内部区域之间的基因表达差异比时间点之间的差异更明显。
图2 6.5-7PCW人胚胎心脏的单细胞基因表达分析因为ST点含有基因表达特征。平均30个细胞(图S1L-S1O)，我们用scRNA-seq分析了6.5个PCW组织样本的基因表达异质性。具体地说，我们检查了6.5-7PCW样本的生物复制(即第二个人类胚胎心脏组织样本)，因为IHC染色表明中间时间点显示了在其他两个阶段识别的解剖学特征。组织被解剖成两个区域不同的部分：一个包含OFT、房室结构和大部分心房，另一个包含心室。这促进了细胞的分离，同时保留了所研究的细胞是来自心脏上部还是下部的信息。
图S1 使用10X Genomics Chromium workstation，我们生成了3,717个单细胞转录组图谱，在质量调整和过滤之后，平均每个细胞2900个基因，11,000个唯一转录本(图S3A-S3C；表S1B)。
图S3 为了验证这个6.5PCW心脏样本可以被认为是ST分析的6.5PCW心脏的生物复制，我们比较了两个样本的scRNA-seq和ST Bulk基因表达的相似性。观察到了很强的相关性(r=0.93；图3A)，证明了生物学比较的合理性。我们鉴定了两个6.5个PCW样本之间共有的18,046个基因，其中2,027个基因仅在scRNA-seq样本中表达，1,174个基因是ST样本所独有的。 最后，我们对两个单细胞组分的基因表达谱进行了降维和聚类，确定了15个细胞簇(图3B)，并根据标记基因的表达将其分类为细胞类型(表S3)。我们能够识别已知的心肌细胞类型，从心肌细胞和成纤维细胞到平滑肌细胞和内皮细胞。此外，我们还检测到三种类型的心肌细胞，即心脏神经嵴细胞、雪旺祖细胞、心外膜细胞、EPDCs(Master and Riley，2014；Sylva et al.，2014)，两种类型的内皮细胞，以及四种类型的成纤维细胞样细胞。某些细胞团仅在细胞组分(I)中检测到(图3C)，提示心脏上部细胞多样性丰富，包括OFT、心房肌、房室心外膜下间充质、瓣膜装置和带有肺静脉的纵隔组织。
图3 心脏发育过程中细胞基因表达图谱的构建为了阐明人类胚胎心脏中存在的不同细胞类型的空间分布及其空间域的异质性，我们利用ISS的亚细胞空间分辨率，将其应用于ST分析的三个心脏组织，使得以单细胞分辨率进行基因表达的时空分析成为可能。为此，我们设计了一个基因小组，用来自两个匹配的6.5-7个PCW生物样本的ST和scRNA-seq分析的信息。具体地说，初始基因组的一半由ST鉴定的关键空间标记基因组成，另一半由每个scRNA-seq簇(免疫细胞除外)的标记基因组成，以剖析细胞类型的异质性。我们随后添加了之前报道的对心脏发育重要的基因，最终得到了69个基因(表S4A和S4B)。在仅使用面板中包括的69个基因对scRNA-seq数据集进行重新聚类后，我们能够将大多数细胞分配到它们的原始簇；唯一的例外是簇13，其中不包含特定的标记基因(图S4A-S4C)。我们在所有三个重复的心脏上进行了ISS实验(表S4C；图S4D)，并观察到时间阶段内的高度相关性(R2=0.85-0.99)。我们还使用单分子RNA荧光原位杂交(SmFISH)交叉验证了三个ISS基因探针的结果(图4)，它产生的模式与测序观察到的模式相似。
图S4
图4 最后，我们使用ISS的功能和pciSeq方法(Qian et al., 2019)创建了在6.5-7PCW胚胎人类心脏中确定的scRNA-seq定义的细胞类型的综合概率空间细胞图(图5)。除了空间位置之外，细胞映射算法利用scRNA-seq数据将读数分配给各个细胞(图5A、5C和5E)。我们的空间图包含20，920个单细胞(即组织切片中细胞总数的76.2%)，这些细胞被成功地分配给scRNA-seq定义的细胞类型(不包括红细胞和免疫细胞，它们被排除在分析之外)(图5B和5D)。空间细胞映射证实了ST预测的簇的空间分布，也解决了由不同细胞类型形成的更精细的结构，这些结构位于彼此接近的位置。
图5 用空间分析方法解开细胞类型相似性的纠缠ISS分析显示，在6.5-7个PCW心脏中，清晰的空间基因表达模式与所研究的细胞类型的ST和scRNA-seq结果一致(不包括免疫细胞和红细胞)。图6A-6B和S5A中给出了三种技术之间一致性的示例。ISS的结果使我们通过将scRNA-seq结果与相应的空间标记基因的结果进行比较，对几个scRNA-seq簇有了更深入的了解。
S5 A 值得注意的是，我们在第14簇中确定了两种细胞类型的亚群：表达ISL1(Engleka et al., 2012)和STMN2(Anderson and Axel, 1985; Groves et al., 1995; Burzynski et al., 2009)的心脏神经嵴细胞和表达ALDH1A1的Schwann祖细胞(Petersen and Adameyko, 2017; Jessen and Mirsky, 2019)(图6A)。这两种细胞均存在于纵隔间充质和外膜间充质中，向心外膜下间充质方向也可检测到雪旺祖细胞。通过分析三个发育阶段OFT内这些基因的ISS图谱，我们发现心脏神经嵴细胞只出现在发育的早期，而雪旺祖细胞只出现在发育的后期(图6C和6D)，而且，心脏神经嵴细胞在任何时间点都不存在于心外膜下间充质中(图6E和6F)，但在发育的后期，雪旺祖细胞才出现在这个区域中(图6C和6D)。
图6 我们还确定了心外膜细胞(第9群)和EPDCs(第3群)之间的主要区别。心外膜细胞以ITLN1的表达为特征，主要分布于心脏周围的心外膜层。标记基因TBX18在这两种细胞类型中都有表达(Wu et al., 2013)，而TCF21(Braitsch and Yutzey, 2013)更多地定位于心外膜下，在那里发现了EPDCs(图6B)。图6E和图6F中的时间分析显示了心外膜细胞(ITLN1，TBX18)和EPDCs(TBX18)在所有三个时间点的房室外膜下间充质内的定位。在4.5-5PCW的心脏中，心外膜几乎覆盖在心包表面，只有发育中的心外膜下的痕迹可见。相反，在后两个时间点，房室心外膜下间充质已经形成并由EPDCs填充。其他技术重复样本也得到了类似的结果(图S5B-S5E)。
图S5B-S5E 我们还解剖了由EPDCs(簇3)和成纤维细胞样细胞(簇2、4、5和8)组成的scRNA-seq簇团聚体(图3B)。对这些群集进行更深入的检查发现，它们具有不同的空间位置和独特的功能属性(图S5A和S6)。EPDCs主要存在于房室外膜下间充质(图6G)，主要参与器官和肌肉的发育(图S6B)。在成纤维细胞样细胞中，与簇2相关的细胞主要位于OFT的底部和瓣膜结构内，而与簇5相关的细胞主要位于OFT内，参与OFT的形态发生。房室心外膜下间充质中也有簇5的表达，提示参与了冠状动脉的形成(图S6)。群4和群8具有相似的空间格局。但是，第4簇在心外膜下更为明显，参与结缔组织的发育和血管生成，而第8簇则更多地定位于OFT，与动脉和主动脉的形态发生和内皮细胞增殖的调控更具特异性。
图S6 重要的是，我们发现了三种类型的心肌细胞(图3B)，这三种类型的心肌细胞在所有三个研究的发育阶段都被检测到。其中两个表达心房和心室肌细胞的特异性标记，与其空间定位一致(图S5A)。相反，第三个群体，表达MYOZ2和FABP3，定位于心房和心室，但以前在人类心脏发育中没有描述过。我们将这一新的心肌细胞群体命名为Myoz2富集的心肌细胞，因为它最近在成年小鼠心脏中被报道过(Gladka et al., 2018)。 最后，对两种内皮细胞类型(第0和第10簇)的进一步空间观察显示，前一种内皮细胞(称为毛细血管内皮细胞)主要定位于小梁心肌，那里的血液主要通过较小的血管(主要是毛细血管)供应。相反，后一种类型(注释为内皮/周细胞/外周细胞)主要定位于致密心肌，冠状动脉向心脏供应氧合血液(图S5B-S5E)。总而言之，这些发现证明了空间基因表达分析在区分相对相似的细胞类型的定位和功能方面的关键作用。 为了方便我们图集的使用，我们提供了一个公开可用的网络资源，用于直观地探索调节人类心脏发育的空间基因表达模式(https://hdca-Sweden./a-Study-on-Human-Heart-Development/)。该资源包含ST和scRNA-seq数据的浏览器、ISS信息的查看器和6.5 PCW胚胎心脏的3D查看器。建立3D模型的9个ST组织切片可以询问全局和单个空间基因表达模式，以便研究心脏器官发生的一般和详细动力学(图7A)。此外，从ISS数据导出的空间细胞图与3D模型对齐，以提供细胞分辨率(图7B)。
图7 讨论了解调节器官和疾病发展的不同细胞类型的生物学功能、网络和相互作用需要细胞信息和空间背景。报告了将空间信息与scRNA-seq数据相结合的各种开创性方法(Moncada et al., 2019; Achim et al., 2015; Satija et al., 2015; Karaiskos et al., 2017)。然而，其中大多数是通过利用现有的原位杂交标志性基因数据来研究模式生物发展的计算策略(Achim et al., 2015; Satija et al., 2015; Karaiskos et al., 2017)。由于模型系统不能反映物种之间的细微差异，这类详细信息不容易应用于人类器官发生的研究。因此，显然需要人类发育组织的空间分辨单细胞转录数据。 在这里，我们提出了一种创新的方法，它结合了三种不同技术(ST、scRNA-seq和ISS)的力量，以单细胞分辨率在器官水平上综合表征人类心脏形态发生过程中基因表达的空间和时间差异。我们获得了四个人胚胎心脏的转录快照，横跨三个不同的发育阶段(4.5-5，6.5-7和9个PCW)，从而能够分析心脏结构形成的进程。虽然研究早期人类心脏组织的形成过程非常有趣，但这样做会带来很大的实际困难。 这些技术中的每一项都有关键功能，使我们能够生成发育中的人类心脏的分辨率良好的细胞图谱。我们使用ST的探索能力来确定三个发育阶段共有的空间全基因组表达模式。此外，利用scRNA-seq对发育中期的细胞类型异质性进行了降维处理。这两项技术的结合使我们能够识别出一套全面的基因探针，这些探针可以总结空间和细胞信息，重现人类心脏发育过程中的整体复杂性。最后，ISS的目标分辨率使我们能够创建跨越三个发育阶段的精细化亚细胞基因表达图谱。通过这种方式，我们建立了一种在细胞水平上研究人类心脏发育过程中时空基因表达模式的分子方法。 我们协同使用这些技术揭示了全局空间基因表达模式是在胚胎心脏发育的早期(4.5-5PCW)建立的，并一直维持到9PCW。特别是，我们观察到心室和心房肌、房室间充质、心外膜和OFT区域的保守空间基因表达模式。相反，在三个发育阶段，心外膜、EPDC的形成与成纤维细胞、血管结构、纤维环、瓣膜和肌肉结构的形成之间的联系在时空上存在差异。在这三个发育阶段，心外膜、EPDC的形成与成纤维细胞、血管结构、纤维环以及瓣膜和肌肉结构的形成之间的联系存在时空差异。具体地说，ST鉴定的心外膜空间标记基因在单细胞分析中被标注为心外膜细胞和EPDCs的两种细胞类型表达。将这些基因包括在我们的ISS基因小组中表明，尽管4.5-5PCW心脏的表面被心外膜细胞覆盖，但通过上皮到间质的转变形成EPDC才刚刚开始，在这个发育阶段。在发育后期，心外膜下间充质中EPDC的形成一直持续，可能随后促进了几种成纤维细胞样细胞的分化。目前尚不清楚EPDCs是否也能分化为心肌细胞，或通过外体影响心肌细胞的分化。 另一个值得注意的发现是，心脏神经嵴细胞和雪旺祖细胞表现出截然不同的时空模式。具体地说，心脏神经嵴细胞在心脏发育的早期阶段独特地存在于纵隔和OFT中。这证实了Keyte等人(2014)的分析，他认为在这里分析的发育阶段，心脏神经嵴细胞是OFT进入主动脉和肺成分的间隔所必需的。相反，雪旺祖细胞在发育后期首先出现在纵隔和OFT。此外，在房室心外膜下间充质区域也只有在发育后期才能看到它们的存在。心脏神经嵴细胞和雪旺祖细胞之间的确切关系尚未最终解决。 我们的方法还使我们能够识别由EPDCs和四种不同的成纤维细胞样细胞类型以及两种内皮细胞类型组成的scRNA-seq簇状复合体内的差异。在早期的研究中也观察到了集群成团(DeLaughter et al., 2016; Gladka et al., 2018; Cui et al., 2019)，但之前没有被解剖过。我们发现，四种成纤维细胞样细胞类型和两种内皮细胞类型中的每一种都有特定的空间位置，并在心脏发育过程中发挥不同的功能。此外，我们还发现，一种独特的成纤维细胞样细胞类型(成纤维样细胞/平滑肌细胞，scRNA-seq簇5)与内皮细胞一起，促进了发育中心脏冠状动脉的形成。 最后，我们鉴定了三种类型的心肌细胞。其中心房和心室心肌细胞分别特异定位于心房和心室，而第三种心肌细胞Myoz2富集存在于两个解剖区域。重要的是，这个群体有一个类似于最近在成年小鼠心脏中描述的表达谱(Gladka et al., 2018)，但以前在人类心脏发育中没有描述过。鉴于MYOZ2在肥厚性心肌病的一个亚组中的已知作用，探索这一亚组心肌细胞的生物学功能可以为研究心脏功能和心脏病理机制提供重要信息(Osio et al., 2007)。 总而言之，我们使用单细胞时空方法研究了人类心脏发育，并构建了一种分子方法，可以用来探索其他信息很少的生物的发育过程。我们的方法使得探索组织中的全球空间转录模式成为可能，降维描述它们的细胞异质性，并有选择地针对具有空间异质性表达模式的关键基因，这些表达模式是导致细胞类型差异的原因。据我们所知，我们的心脏发育模型是首批具有单细胞空间分辨率的器官范围的人类发育-转录图谱之一。为了方便它的开发，我们创建了一个公开可用的网络资源，可以用来研究和可视化2D和3D模型(https://hdca-sweden./a-study-on-human-heart-development/)，以了解心脏发育过程中的时空基因表达模式。这些模型清楚地表明，空间和时间信息与单细胞基因表达数据的整合对于识别细胞类型之间的关键差异和详细分析发育中的组织是必不可少的。
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