USP26通过稳定Snail促进食管鳞状细胞癌转移

写在前面

     今天推荐的是由中国科学院生物物理研究所在2019年4月28日发表于Cancer Letters（2020IF：8.679，JCRQ1）的一篇文章，通讯作者是Zhihua Liu教授，研究表明USP26通过稳定Snail促进食管鳞状细胞癌转移。

研究背景

      Snail是上皮间质转化（EMT）的重要转录因子，与肿瘤患者的预后不良和肿瘤转移有关。Snail是一种易受感染的蛋白质，可被泛素-蛋白酶体系统降解。有多种E3连接酶介导其降解，但去泛素化酶能否逆转Snail降解尚不完全清楚。

摘要部分

  在这项研究中，作者筛选了一个DUB文库，发现USP26是一种有效的去泛素化酶，可介导Snail稳定。作者还发现USP26能够促进食管鳞状细胞癌(ESCC)细胞迁移和侵袭，并且在ESCC样本中高度表达。作者的观察表明，USP26是一种新型的Snail去泛素化酶，它为食管癌转移的治疗提供了潜在的靶点。

研究内容

1. USP26增加了Snail的稳定性

     为了找到增加Snail稳定性的潜在去泛素化酶，作者筛选了DUB cDNA表达文库。作者将各种去泛素化酶和Snail共转染到HEK293T细胞中。为了扩大差异并消除假阳性结果，细胞在收获前用CHX处理两小时。作者发现USP26显着增加了Snail的稳定性（图1A）。DUB3还增强了Snail的稳定性。为了进一步验证USP26上调Snail的蛋白质水平，作者在HEK293T细胞中共表达了Snail和USP26。USP26的异位表达显着增加了Snail蛋白水平（图1B）。此外，通过以剂量依赖性方式过表达USP26，Snail的蛋白质水平增加（图1C）。接下来，作者测试了ESCC细胞系中USP26和Snail的蛋白质水平，发现它们之间存在正相关（图1D）。然后作者在KYSE30细胞中稳定过表达USP26并在KYSE150细胞中敲低USP26。免疫印迹分析结果显示，过表达USP26导致KYSE30细胞中Snail蛋白的显着增加（图1E），并且USP26的敲低伴随着KYSE150细胞中Snail蛋白表达的降低（图1G）。同时，Snail的mRNA水平不受KYSE30（图1F）和KYSE150细胞（图1H）中USP26变化的影响。

图1. 去泛素化酶USP26稳定Snail

研究结论：USP26通过翻译后修饰提高了Snail的蛋白质水平，它可能是Snail的去泛素化酶。

2. USP26与Snail相互作用

     为了研究USP26介导的Snail蛋白上调的机制，作者将Flag-USP26和Snail共转染到HEK293T细胞并进行了co-IP检测。结果显示Snail被USP26共免疫沉淀（图2A）。此外，用USP26和Flag-Snail共转染的HEK293T细胞进行了co-IP实验，进一步证明了USP26和Snail之间的相互作用（图2B）。为了进一步确定负责介导Snail相互作用的USP26区域，作者生成了USP26的三个截短突变体。co-IP实验表明，包含USP域的USP26突变体能够与Snail相互作用（图2C），表明USP26的USP域负责其与Snail的相互作用。作者还生成了三个截短的Snail突变体，以找到与USP26相互作用的Snail区域。作者发现包括锌指结构域的Snail的C端介导了与USP26的相互作用（图2D）。此外，来自KYSE150细胞裂解物的内源性USP26和Snail也被共免疫沉淀，这证实了Snail和USP26在生理条件下的相互作用（图2E）。免疫荧光测定表明内源性USP26和Snail共定位于KYSE30和KYSE150细胞的细胞核中（图2F）。

图2. USP26与Snail相互作用

研究结论：USP26在核中与Snail发生物理相互作用，并且这种相互作用是由USP26的UPS结构域和Snail的锌指区域介导的。

3. USP26通过去泛素化稳定Snail

      由于USP26是一种去泛素化酶，作者试图确定USP26是否通过其去泛素化酶活性调节Snail蛋白水平。作者通过用丝氨酸残基(C304S)替换催化半胱氨酸来生成USP26突变体。co-IP测定的结果显示USP26突变体仍然与Snail相互作用。然而，USP26突变体未能上调Snail蛋白水平。然后，作者通过将Snail与USP26或USP26 突变体共转染到HEK293T细胞来进行CHX-脉冲-追踪测定。用放线菌酮抑制蛋白质合成后，Snail蛋白水平迅速下降，过表达USP26而不是USP26突变体阻止了Snail的降解（图3A）。作者进一步测试了USP26对ESCC细胞系中Snail降解的影响。作者观察到USP26的过表达延迟了KYSE30细胞中Snail的降解（图3B），并且在KYSE150细胞中敲低USP26（图3C）缩短了Snail的半衰期。接下来，为了确定USP26稳定Snail蛋白是否是由去泛素化介导的，作者探究了USP26对Snail泛素化的影响。作者将USP26或USP26突变体与Flag-Snail和HA-泛素共转染到HEK293T细胞。用MG132处理后，作者发现USP26的异位表达显着降低了其泛素化水平，但USP26突变体没有这种影响（图3D）。此外，USP26的异位表达还降低了KYSE30细胞中内源性Snail的泛素化，并且USP26的敲低增加了KYSE150细胞中的Snail泛素化水平（图3E，F）。作者还用一系列突变泛素进行了泛素化分析。结果表明USP26只能从Snail蛋白中去除K48连接的泛素链（图3G）。

图3. USP26稳定和去泛素化Snail

研究结论：USP26通过降低其泛素化来保持Snail的稳定性。

4. USP26通过诱导EMT促进ESCC转移

     由于Snail是一种转录因子，可抑制E-cadherin表达以诱导EMT进展，作者在USP26过表达或敲低的ESCC细胞中检测到几种EMT标志物，如E-cadherin、N-cadherin和Vimentin。作者的结果表明，在过表达USP26的KYSE30细胞中，E-钙粘蛋白等上皮标志物减少，N-钙粘蛋白和波形蛋白等间充质标志物增加（图4A）。相反，敲低USP26增加了E-钙粘蛋白并下调了KYSE150细胞中的N-钙粘蛋白和波形蛋白（图4B）。EMT是许多实体瘤转移的重要事件，而Snail是EMT的重要调节剂。因此，作者测试了USP26是否促进ESCC细胞的转移。在体外，USP26过表达增强了KYSE30细胞的迁移和侵袭能力，而不是USP26突变体（图4C）。相反，USP26的敲低抑制了KYSE150细胞的迁移和侵袭（图4D）。接下来，作者使用尾静脉注射小鼠模型来检测USP26对体内ESCC转移的影响。KYSE30细胞中USP26过表达显着上调肺结节的数量（图4E）。但USP26突变体失去了促进肺转移的能力。USP26的敲低抑制了KYSE150细胞的肺转移（图4F）。为了进一步确定USP26通过增加Snail稳定性促进ESCC迁移和侵袭，作者敲低了USP26过表达KYSE30细胞中的Snail或USP26敲低KYSE150细胞中异位表达的Snail。Transwell测定显示USP26促进KYSE30细胞迁移和侵袭的功能在很大程度上被Snail的敲低逆转（图4G）。Snail的过表达可以大大增加对USP26敲低细胞的迁移和侵袭能力（图4H）。

图4. USP26促进ESCC细胞迁移和侵袭

研究结论：USP26通过增加Snail稳定性和诱导EMT的进展来促进ESCC转移。

5. USP26和Snail在ESCC样本中均匀过表达

     为了进一步研究USP26和Snail在ESCC中的关系，作者探究了USP26和Snail在ESCC组织和配对的相邻正常组织中的表达。免疫组织化学染色显示ESCC样品中的USP26蛋白水平远高于正常组织（图5A），表明USP26在ESCC中的致癌作用。此外，在ESCC和邻近的正常组织中，USP26和Snail蛋白水平之间存在显着的正相关（图5B-D）。

图5. Snail在ESCC中的表达与USP26呈正相关

研究结论：USP26和Snail蛋白水平之间存在显着的正相关。这种正相关进一步证明了USP26与Snail之间的调节关系。

结论与讨论

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