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学术查 267篇原创内容 公众号 小胶质细胞（Microglia）是大脑的免疫细胞，是中枢神经细胞的第一道也是最主要的一道免疫防线。稳定调控小胶质细胞的平衡状态，对于中枢神经系统的发育和维持非常关键，过多激活甚至导致小胶质细胞失控，会带来神经毒性的伤害，引发神经退行性疾病。 小胶质细胞平衡状态调控的重要机制包括减少炎性损伤、促进组织修复、代谢重编程等。 小胶质细胞在感染、外伤、缺血缺氧性损伤等外部因素刺激下，脑内微环境中IL-1β、LPS、TNF-α等作用于小胶质细胞，使其从静息分支状态向阿米巴样激活状态转变，产生TNF-α、IL-12、IL-1β、IL-6等促炎因子，或者IL-10、IL-4、TGF-β、IL-13等抗炎因子。 代谢重组是指小胶质细胞代谢方式发生变化，以氧化磷酸化减少、糖酵解增加为特征。因此，小胶质细胞具有“可塑性”，即可根据神经系统微环境的变化，调控代谢途径进行代谢重组，从而改变转录表型和功能表型，影响疾病的进程。 深入了解小胶质细胞的代谢重编程在神经退行性疾病中的作用，可为开发更有效的神经退行性疾病治疗靶点提供新策略和新思路。 小胶质细胞的调控机制 2021年度国自然医学部国自32大科研热点的中标数统计如下：
今天给大家带来的文章是来自苏州大学发表在aging cell（IF=9.304）题为“Microglial MT1activation inhibits LPS-induced neuroinflammation viaregulation of metabolic reprogramming”的文章，即小胶质细胞 MT1 激活通过调节代谢重编程抑制 LPS 诱导的神经炎症。 ∞研究概要∞ 作为最常见的神经退行性疾病，帕金森病的发病机制至今仍不清楚。前人的研究表明，小胶质细胞介导的神经炎症对帕金森发病机制呈现明显相关性。褪黑素受体MT1广泛存在于黑质（SN）的胶质细胞和神经元上。作为一种神经保护因子，很大程度也参与了帕金森的发病机制。作者在PD小鼠通过MPTP诱导发现，SN小胶质细胞上的MT1明显减少。增加小胶质细胞的MT1能够显著抑制LPS诱导的神经炎症，而减少MT1则显著增加神经炎症的症状。小胶质细胞的代谢重编程促进MT1的消炎作用，过量的LPS会损伤有氧糖酵解和氧化磷酸化过程，而增加MT1则可以逆转这一过程。作者发现，MT1能够正向调节丙酮酸脱氢酶PDHA1的表达，增强OXPHOS。另外，MT1也能减少培养基对多巴胺细胞系的毒性，在模型小鼠能够观察到增加MT1能够增强消炎作用。 分子机制图 1、Mtr1a缺乏造成小胶质细胞基于LPS诱导的促炎症因子的聚集和上调 作者敲低了 BV2 细胞中编码 MT1 的Mtnr1a以评估 Mtnr1a 缺乏是否可能影响 LPS 诱导的小胶质细胞激活。发现 LPS 促进了 iNOS 和COX-2 的产生，而用 小干扰 RNA（siRNA）转染细胞增加了产量而不影响 BV2 细胞活力（图 1a）。在原代小胶质细胞中，MT1 缺乏也明显增强了 LPS 诱导的iNOS 和 COX-2 的表达（图 1f）。Mtnr1a 下调后的初级小胶质细胞表现出类似变形虫的特征，细胞体膨胀，暗示其细胞激活（图 1g）。LPS 明显增加了 iNOS、COX-2、IL-6 和 TNF-α的 mRNA 水平，Mtnr1a 敲低 BV2 细胞的增加幅度更大（图 1b-e）。这些数据表明，小胶质细胞中 Mtnr1a 的缺乏加剧了对 LPS 的促炎因子反应的产生。 2、MT激动剂Ramelteon抑制LPS诱导的小胶质细胞促炎因子的产生 用广谱性 MT 激动剂Ramelteon 预处理LPS 刺激的 BV2 细胞或原代小胶质细胞，以剂量依赖性方式显著抑制促炎蛋白（如 iNOS 和 COX-2）的增加，而不影响细胞活力（图 1h、m）。同时，这些促炎因子的mRNA 水平以及 IL-6 和 TNF-α 的 mRNA 水平也被下调（图 1i-l）。这些数据表明，MT1 激活可以抑制 LPS 诱导的小胶质细胞激活。 图1 3、Ramelteon的抗炎作用特别依赖于MT1 为了排除任何受体非依赖性对 Ramelteon 抗炎作用的影响，作者在 Ramelteon 治疗前用 MT 拮抗剂 Luzindole 处理BV2 细胞。Luzindole 以剂量依赖性方式抑制Ramelteon 的抗炎作用（图 2a）。在 LPS 处理的 BV2 细胞中，MT2 特异性激动剂(IIK7) 和 MT2 敲低均未对 Ramelteon 诱导的抗炎反应产生任何影响（图 2b），用拮抗剂 (4P-PDOT) 处理的细胞也是如此（图 2c）。相比之下，BV2 细胞中的Mtnr1a 敲低抑制了 Ramelteon 的抗炎作用（图2d-f）。这些数据表明，MT1 激活对于抑制LPS 诱导的炎症至关重要。 4、MT1激活的抗炎作用独立于经典的GPCR信号 LPS 诱导的小胶质细胞活化不受 SQ22536 预处理的影响，因此，MT1 激活的抗炎作用与 GPCR的Gαi 信号无关（图 2g）。作者又测试了另一种与 MT1 相关的 G 蛋白 Gαq，发现在施用 Ramelteon 和 LPS 之前用PLCβ 抑制剂 U73122 预处理 BV2 细胞不影响 Ramelteon 的抗炎作用，因此，Gαq 信号不参与 MT1 激活的抗炎作用（图 2h）。这两个实验表明，MT1的消炎效果与GPCR信号无关。 图2 5、小胶质细胞代谢重编程参与MT1活化的抗炎作用 作者使用试剂盒来测定葡萄糖和乳酸，以测量不同处理下小胶质细胞的葡萄糖消耗和细胞外乳酸的产生。与之前的研究一致，LPS 促进细胞培养基中的葡萄糖消耗和乳酸产生（图 3a、b、e、f）。当 Mtnr1a 被敲低时，BV2 细胞（图 3a，b）和原代小胶质细胞（图 3e，f）中的葡萄糖消耗和细胞外乳酸产生增加。相反，在用 Ramelteon 预处理的 BV2 细胞（图 3c、d）或原代小胶质细胞（图 3g、h）中，葡萄糖消耗和乳酸产生受到显著抑制。这些结果表明，小胶质细胞 MT1 激活可以将其代谢状态从有氧糖酵解转变为 OXPHOS。有趣的是，用 2-DG 预处理细胞逆转了由 Mtnr1a 敲低引起的 LPS 诱导的炎症的增加（图 3i）。这些数据意味着，代谢重编程调节确实参与了 MT1 调节的炎症。 图3 6、丙酮酸脱氢酶亚基PDHA1参与MT1介导的小胶质细胞代谢重编程 作者从 Mtnr1a 缺陷和正常小胶质细胞中分离并测序总 RNA。与正常组相比，在 Mtnr1a 缺陷的小胶质细胞中共有 186 个基因上调，384 个基因下调（图 4a，b）。KEGG显示其中许多基因与某些代谢途径有关，包括丙酮酸代谢、柠檬酸循环和脂肪酸代谢（图 4a、c）。热图揭示了表达发生显著变化的基因，发现 Pdha1 在 Mtnr1a 缺陷型小胶质细胞中表达显著降低（图4d）。在转录水平，Pdha1 表达在Mtnr1a 缺陷型 BV2 细胞中显著降低（图 4e），而在 Ramelteon 处理（MT1 激活）细胞中显著增加。类似地，MT1 在 BV2 细胞（图 4g，h）和原代小胶质细胞（图 4i，j）中正调节蛋白质水平的 PDHA1 表达。Pdha1 敲低几乎消除了 MT1 激活的抗炎作用（图 4k-m）。 图4 7、MT1 激活抑制小胶质细胞介导的 DA 神经元死亡 有或没有 Mtnr1a 敲低BV2 细胞，从 Ramelteon 预处理到LPS 刺激，制备了条件培养基 (CM)，用于培养 DA 细胞系MES23.5（图 5a）。MES23.5 细胞用 Hochest 和碘化丙啶 (PI) 染色（图 5b、c），并测定cleaved-caspase3 以评估细胞凋亡（图 5d、e）。来自LPS 刺激的 BV2 细胞的 CM 的神经毒性明显增加，而当细胞与来自用 Ramelteon 预处理的 LPS 刺激的 BV2 细胞的 CM 一起培养时，细胞存活率显著增加。此外，与对照组相比，来自 Mtnr1a 敲低 BV2 细胞的CM 增加了 MES23.5 的细胞死亡。然而，BV2 细胞中 Mtnr1a 敲低几乎消除了 Ramalteon CM 的这种保护作用（图 5b-e）。这些数据表明，MT1激活减弱了小胶质细胞介导的 DA神经元死亡。 图5 8、Ramelteon在 LPS 诱导的神经炎症小鼠模型中抑制小胶质细胞激活和小胶质细胞介导的 DA 神经元丢失 通过将 LPS 立体定向注射到小鼠的 SN 中来构建LPS 诱导的炎症小鼠模型。MT1 在小鼠 SN 的小胶质细胞中表达（图 6a）。在 LPS 注射之前和之后腹膜内注射 Ramelteon（图 6b），随后通过免疫组织化学进行分析。LPS 处理显著增加了 SN中 Iba1（小胶质细胞标记物）和GFAP（胶质酸性纤维蛋白；星形胶质细胞标记物）的水平。然而，在 Ramelteon 处理组中，LPS 诱导的 Iba1 和 GFAP 的表达在 SN 中显著降低（图 6c）。此外，LPS诱导的酪氨酸羟化酶 (TH ) 神经元丢失也显著减弱（图 6d）。Ramelteon 预处理可以显著逆转LPS 诱导的 Iba1 增加和小鼠中脑中 TH 表达的减少（图 6e）。 9、Ramelteon 在 MPTP 诱导的 PD 小鼠模型中抑制DA 神经元丢失和小胶质细胞激活 在小鼠 SN 中，MPTP 损伤诱导小胶质细胞MT1 减少（图 6f）。Ramelteon 治疗减轻了 MPTP 诱导的 TH 神经元丢失（图 6g）和 SN 中 TH 表达的减少（图 6h）。Iba1 和 GFAP 的丰度在 MPTP 处理组的 SN 中增加，而Ramelteon 抑制了这种增加（图 6i）。因此，MT 激动剂 Ramelteon 在MPTP 诱导的 PD 小鼠模型中具有神经保护作用。 图6  学术查 分享实验技巧，解读文章，关注国自然申请，协助图像查重，反对科研内卷。 267篇原创内容 公众号 |
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