片仔癀对肺癌细胞增殖、迁移、侵袭的抑制作用及其机制研究

廿氏春秋 2021-11-15

展开全文

摘要：目的研究片仔癀对肺癌A549细胞增殖、迁移、侵袭的抑制作用及其机制。方法以人肺癌A549细胞作为体外实验对象，分别用不同质量浓度的片仔癀处理，MTT检测细胞增殖变化，Transwell小室测定细胞侵袭和迁移变化，Western blotting检测细胞中侵袭、迁移蛋白MMP-9、MMP-2和上皮细胞-间充质转化（EMT）蛋白E-cadherin、vimentin及Akt信号通路蛋白Akt磷酸化水平。用Akt信号通路激活剂和片仔癀处理肺癌细胞，检测激活Akt信号通路对片仔癀抗肺癌细胞增殖、侵袭和迁移的作用。结果 100 μg/mL的片仔癀对肺癌细胞增殖能力没有影响（P＞0.05），200 μg/mL的片仔癀处理可以明显降低肺癌细胞增殖能力（P＜0.05）。100、200 μg/mL的片仔癀处理后的肺癌细胞侵袭和迁移能力均降低，细胞中MMP-2和MMP-9蛋白表达水平下降，E-cadherin蛋白水平升高，vimentin蛋白水平降低，同时细胞中Akt磷酸化水平也下降（P＜0.05）。Akt信号通路激活剂处理可以明显减弱片仔癀对肺癌细胞增殖、侵袭、迁移的抑制作用（P＜0.05）。结论片仔癀具有降低肺癌细胞增殖、迁移、侵袭能力，作用机制与抑制Akt信号通路的激活有关。

随着工业化加速发展和环境污染等因素的影响，肺癌已经成为严重威胁人类生命健康的常见恶性肿瘤，目前对于肺癌的治疗以手术切除、放射治疗和化疗为主，但是由于这些治疗手段具有一定的局限性和不良反应，寻找新的有效药物对于肺癌的治疗具有重要意义^[1-2]。片仔癀是我国传统名贵中目前对于片仔癀对肺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响尚不清楚。本实验以人肺癌细胞A549为模型，研究片仔癀对其增殖、迁移和侵袭的抑制作用和相关机制，为片仔癀治疗肺癌的临床应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

人肺癌A549细胞购自北纳生物细胞资源中心；片仔癀（规格3 g/粒，批号1801008）购自漳州片仔癀药业股份有限公司；p-Akt抗体、E-cadherin抗体、Akt抗体购自美国Santa Cruz Biotechnology公司；MMP-9抗体和MMP-2抗体购自美国Abcam公司；vimentin抗体购自美国BioVision公司；Akt信号通路激活剂IGF-1购自美国Sigma公司。

1.2 MTT法测定肺癌细胞增殖

A549细胞接种到96孔细胞培养板内，每孔中加入100 μL的细胞悬浮液（约含有2 000个细胞），培养过夜后，将孔内的培养液吸弃，添加含有片仔癀（超纯水溶解）终质量浓度为0、100、200、400、800、1 600 μg/mL的细胞培养液，放在培养箱中继续培养24 h，取出培养板，在每个孔内加入10 μL的MTT溶液，置于孵育箱内培养4 h，将孔内的上清吸弃，再分别添加100 μL的DMSO，孵育10 min后，于490 nm检测吸光度（A₄₉₀）值。

1.3 Transwell小室测定肺癌细胞迁移和侵袭

分别在Transwell小室的上室内加入用不含血清的细胞培养液悬浮的细胞200 μL（同时在细胞培养液中分别添加0、100、200 μg/mL的片仔癀），依次在下室中加入500 μL含10%胎牛血清的细胞培养液，放在培养箱内继续培养24 h，取出培养板，添加磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，放在4%多聚甲醛中浸泡30 min，置于结晶紫溶液中染色，置于显微镜下计数穿膜细胞数量即为细胞迁移数目，随机选取5个视野，取均值。在细胞侵袭实验前2 h用基质胶把小室湿化，后续步骤同迁移实验。

1.4

A549细胞经过0、100、200 μg/mL的片仔癀处理培养24 h后，用添加PMSF的RIPA蛋白裂解溶液提取蛋白，经过BCA蛋白定量检测试剂盒测定浓度后，进行蛋白电泳。电泳前将蛋白样品加入到上样缓冲液中煮沸变性，每孔内设置上样量为40 μg。SDS-PAGE凝胶电泳采用10%分离胶、5%浓缩胶配制，首先用90 V的电压电泳，观察染料进入到分离胶与浓缩胶的交汇处时，换成120 V的电压继续电泳，染料进入到玻璃板的底部以后，停止电泳。裁剪PVDF膜至合适大小，设置200 mA电流转膜，转膜时间设置为50 min。电转移后，把PVDF膜放在5%牛血清白蛋白封闭液中，在室温中孵育1 h；再将PVDF膜放在封闭液稀释的一抗反应液中，置于4 ℃反应过夜；取出PVDF膜，放在封闭液稀释的二抗反应液中，置于室温孵育1 h，经Labwork分析各蛋白条带灰度值大小，以GAPDH为内参，分析E-cadherin、vimentin、MMP-2、MMP-9蛋白表达变化，同时分析p-Akt/Akt值大小。

1.5 Akt信号通路激活剂对片仔癀调控肺癌细胞增殖、侵袭、迁移的影响

A549细胞用100 μg/mL的片仔癀和100ng/mL的Akt信号通路激活剂IGF-1联合处理，为片仔癀＋IGF-1组，经过100 μg/mL的片仔癀和0 ng/mL的Akt信号通路激活剂IGF-1处理后的肺癌细胞为片仔癀组，细胞培养24 h后，按照MTT、Transwell小室、Western blotting方法检测细胞增殖、迁移、侵袭和E-cadherin、MMP-2、vimentin、MMP-9蛋白及Akt磷酸化水平，步骤均同上。

1.6 统计分析

实验数据用SPSS 21.0软件分析，计量资料用表示，E-cadherin、MMP-2、vimentin、MMP-9蛋白及Akt磷酸化水平变化数据间比较经t检验，多组差异比较用单因素方差分析，组间比较采用SNK-q检验。

2 结果

2.1 片仔癀对肺癌细胞增殖的影响

100 μg/mL的片仔癀处理后肺癌细胞增殖能力没有明显变化，200、400、800、1 600 μg/mL的片仔癀处理后肺癌细胞增殖能力明显降低，见表1。为了消除细胞增殖对迁移和侵袭的影响，分别选用

2.2 片仔癀对肺癌细胞迁移和侵袭的影响

2.3 片仔癀对肺癌细胞E-cadherin、vimentin蛋白表达的影响

100、200 μg/mL的片仔癀处理后肺癌细胞中上皮标志物E-cadherin蛋白水平升高，间质标志物 vimentin蛋白水平降低，结果见表3和图1。片仔癀能够在体外抑制肺癌细胞上皮细胞-间充质转化（EMT）。

2.4 片仔癀对肺癌细胞中Akt信号通路激活水平的影响

100、200 μg/mL的片仔癀处理后肺癌细胞中Akt磷酸化水平降低，结果见表3和图1。片仔癀能够在体外抑制肺癌细胞中Akt信号通路激活。

2.5 Akt信号通路激活剂IGF-1逆转片仔癀抗肺癌细胞增殖、侵袭和迁移作用

肺癌细胞经过100 μg/mL的片仔癀和100 ng/mL的Akt信号通路激活剂IGF-1共同处理后，肺癌细胞增殖、侵袭和迁移能力升高，MMP-2和MMP-9蛋白水平也升高，E-cadherin蛋白水平降低，vimentin蛋白水平升高，Akt磷酸化水平也升高，结果见表4和图2。Akt信号通路激活剂IGF-1可以减弱片仔癀抗肺癌细胞增殖、侵袭、迁移和EMT作用。

3 讨论

片仔癀拥有超过450多年的药用历史，是我国传统的中成药，由多种天然药材组成，是国家重点保护的重要制剂^[8-9]。临床药理学表明，片仔癀具有保护脑组织和抗肝炎、胆囊炎、肝损伤等作用，对于结肠癌等肿瘤也具有抵抗作用^[10]。目前对于片仔癀抗肿瘤作用的研究表明，片仔癀处理可以在体外抑制舌鳞癌、骨肉瘤、卵巢癌等肿瘤细胞的生长，对于肿瘤细胞的侵袭和迁移也具有抑制作用^[6,11-12]。本实验在肺癌细胞中证实了片仔癀具有抵抗肺癌细胞增殖、侵袭和迁移的作用，说明片仔癀在肺癌细胞中的作用与在其他肿瘤中的研究报道结果一致，均提示片仔癀具有抗肿瘤功效。

肿瘤细胞EMT是一种发生于肿瘤转移之前的病理现象，表现为上皮细胞特性逐渐消失，并逐渐出现间质细胞特征，发生EMT的肿瘤细胞更容易发生迁移和侵袭^[13-14]。E-cadherin和vimentin是细胞EMT的标志蛋白，E-cadherin是上皮细胞标志蛋白，vimentin是间质细胞标志蛋白，E-cadherin水平下降和vimentin水平升高是细胞发生EMT的重要特征^[15-16]。肿瘤转移除了与细胞EMT有关之外，片仔癀能够降低骨肉瘤细胞中MMP-9等表达水平，对于大肠癌细胞EMT具有抑制作用^[12,18]。本实验结果表明，片仔癀处理后的肺癌细胞MMP-2和MMP-9蛋白水平降低，E-cadherin蛋白水平升高并且vimentin蛋白水平下降，说明片仔癀可以抑制肺癌细胞EMT和合成MMP-9及MMP-2，这提示片仔癀具有抗肺癌细胞转移潜能的作用，与细胞侵袭和迁移检测结果一致。

目前对于片仔癀抗肿瘤具体调控机制尚不明确，在骨肉瘤中的研究表明，片仔癀可以下调骨肉瘤细胞中Akt信号通路的激活水平，从而影响骨肉瘤细胞的生长和耐药等特性^[19]。Akt是存在于人体组织中的信号调节通路，不仅参与人体内正常信号转导，还与人类的疾病发生有关^[20]。在肿瘤中的研究报道已经证实，Akt信号通路在肿瘤中过度激活可以促进肿瘤的转移和进展，而靶向抑制Akt信号通路的激活可能是肿瘤治疗的靶点^[21]。正常情况下的Akt不具备调节功能，其只有被活化后形成p-Akt才可以促进Akt信号激活^[22]。本实验发现，片仔癀可以降低肺癌细胞中Akt信号通路的激活水平，并且激活Akt信号通路可以减弱片仔癀的抗肺癌细胞作用，说明片仔癀可以通过下调Akt信号通路的激活水平发挥抑制肺癌细胞增殖、侵袭和迁移作用。