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荧光抗体技术：以荧光物质标记抗体而进行抗原定位的技术称为荧光抗体技术（Fluorescent antibody technique）。 用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法称荧光抗体法；用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原法。这两种方法总称免疫荧光技术，因为荧光色素不但能与抗体球蛋白结合，用于检测或定位各种抗原，也可以与其他蛋白质结合，用于检测或定位抗体，但是在实际工作中荧光抗原技术很少应用，所以人们习惯称为荧光抗体技术，或称为免疫荧光技术。以荧光抗体方法较常用。用免疫荧光技术显示和检查细胞或组织内抗原或半抗原物质等方法称为免疫荧光细胞（或组织）化学技术。 直接法： 用抗原多次免疫动物，产生抗体，从血清中分离抗体，与荧光色素结合，制备荧光抗体溶液，浸染标本，直接定位标本内的抗原或抗体成分 间接法： 用动物或人免疫球蛋白（IgG）作抗原，免疫动物，产生抗免疫球蛋白抗体（抗抗体）与荧光色素结合，制成抗免疫球蛋白荧光抗体（荧光标记的抗体Ⅱ） 一、荧光抗体的制备 （一）抗原（免疫原） 1 微生物抗原：原虫、真菌、细菌、立 产克体和病毒等 2 组织抗原：人或动物组织内某些成分（如血浆蛋白、细胞内各种酶、激素等） 3 免疫球蛋白（Ig）抗原：家兔、马和人的免疫球蛋白。有种属特异性 家兔和马的免疫球蛋白有4类：IgG、IgM、IgA、IgE 人类免疫球蛋白有5类：IgG、IgM、IgA、IgD、IgE （二）制备免疫血清 效价高和特异性强，荧光抗体沉积在抗原上的沉淀层厚，荧光强，与抗原反应快，结合紧密，增加敏感性 1 高效价免疫血清制备的条件： 抗原要纯，课题合适。砂少，不能有效刺激机体产生 抗体；太多，抑制抗体生成 动物主要为羊、马、家兔和猴等。制备抗人免疫球蛋白抗血清必须健康、反应良好，且能提供足量血清的雄性动物，多用家兔和山羊。体重合乎要求，3公斤左右。注意营养和卫生管理。免疫注射一月后无良好的抗体反应，或在规定注射过程后效价不高，可再注射1~2次，反应仍不佳者，弃去 免疫途径：静脉、腹腔、皮内、皮下和淋巴结内注射。多途径免疫，一次不超过两种。其选择决定于抗原的生物学特性和理化特性，如激素、酶和毒素等生物活性抗原，不宜静脉注射 注射次数：未免疫动物一次注射，抗体生成慢，效价低，持续时间长，特异性高；再次注射出现再次反应，效价上升快，持续时间长，间隔一定时间，多次注射可获得训效价免疫血清，但抗体特异性降低 抗原注射间隔时间：间隔太短，起不到再次反应的效果；太长，免疫持久，影响血清特异性一般1~2周。以抗原性质和抗体反应而定 佐剂：有些抗原，如可溶性蛋白质抗原，在高度纯化时抗原性降低，尤其是IgM、IgA、补体和酶知，只能得到较少的量。必须用一定的免疫佐剂，提高动物的免疫反应性，增强抗体的合成 常用Freund佐剂：羊毛脂1份，医用液体石蜡1份，卡介苗3~4毫克/毫升佐剂 加热充分混合，分装于小青霉素瓶内，10磅8分钟高压灭菌备用。用前取适量卡介苗研磨后，再加一定量不完全佐剂（液体石蜡和羊毛脂）研磨，最后加抗原研磨至乳状液 2 测定抗体和抗体效价 最后一次免疫后10~14天，由家兔 耳静脉取血2~3毫升，测定抗体效价 常用环状沉淀试验： 材料： 待查血清；抗原；小 试管和试管架；环状沉淀管（直径0.4毫米，长40毫米）及试管架；毛细滴管；刻度吸管；生理盐水 方法： 取血清试管5支，置试管架上，每管加生理盐水0.9毫升，混匀，再吸0.1毫升，移入第三管中。连续稀释抗原。最后各管抗原稀释倍数分别为1：10，1：100，1：1000，1：10000，1：100000 用毛细吸管吸取待检血清，置入一系列环状沉淀管的管底，高度约1厘米，勿发生气泡和沾污血液面以上的管壁等 用毛细吸管吸取已稀释的抗原，由稀释倍数最高的管开始，分别沿管壁慢慢加入各沉淀管中，使两液面相连，不使其相混合其间发生气泡，加入的抗原量和血清量相等 室温下静置15~30分钟，观察结果：两液面间有白色环状沉淀物为阳性。发生清洗液环的抗原最高稀释倍数为该抗体的效价。可用双向琼脂扩散及其它免疫学方法测定抗体效价 如抗体超过1：100000,由动物心脏穿刺取血，置无菌瓶或大玻璃皿中，室温下静置1~2小时，冰箱过夜，使血清充分析出。如效价低，再加强免疫一次 （三）提取免疫球蛋白 中性饱和硫酸铵沉淀法 材料： 免疫血清；生理盐水；磷酸盐缓冲液；1%氯化钡或Nessler批示剂；饱和硫酸铵溶液；烧杯250毫升和500毫升；玻棒；离心机（大管）；透析袋 磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.4):氯化钠6克，氯化钾0.2克，磷酸氢二钠1.15克，磷酸二氢钾0.2克 分别溶于蒸馏水1000毫升。先制成10倍浓缩的PBS，不加氯化钠，用前稀释10倍并加入氯化钠 饱和硫酸铵溶液（pH7)：硫酸铵（CP）约400克溶于已加热至70~80℃的蒸馏水1000毫升，搅拌20分钟至硫酸铵完全溶解，溶液透明。冷却至室温，底部析出少量硫酸铵结晶。上清液为饱和硫酸铵溶液。其pH5。用28%氨水调酸碱度至7 方法： 1 提取球蛋白 最好在2~4℃下进行。全部材料用前冷却 血清用一倍盐水稀释，慢慢摇动避免形成泡沫。用吸管一滴一滴加入等量的硫酸铵饱和溶液 详细过程见下图：
2 透析余盐 最后沉淀物溶于少量PBS，装入透析袋中透析 先用自来水透析2~10分钟。以后在PBS中透析 恒定振荡透析袋外液，每天换外液3~5次，一般透析3~5天，直到全部SO4-/NH4+移去 有SO4-存在，加1%氯化钠形成白色沉淀 有NH4+存在，加Nessler指示剂，出现黄色沉淀 也可用葡聚糖凝胶（Sephadex G 50）过滤法除去，简便快速（见后） 3 分装 透析后如球蛋白内有沉淀物，离心除去 最后将收集的球蛋白溶液分别分装在灭菌的小瓶中，加1：10000硫柳汞（Thimerosal）防腐，注明标签和日期，低温或4℃保存。或直接测定蛋白浓度。用异硫氰化荧光素( Flourescein isothiocyanate，FITC) 标记后分装保存备用 （四）制备荧光抗体 1 荧光（色）素 容易与抗体球蛋白结合，不能影响其免疫荧光活性 最好：性能稳定，容易溶解，荧光强，标记简单 常用荧光素有3种： 异硫氰化荧光素( Flourescein isothiocyanate，FITC)：发绿色荧光。最大吸收光谱490~495nm，最大发射光谱520~530nm 四甲基乙硫氰酸罗达明(Tetramethylrhodamine isothiocyanate，TMRITC) ：发橙红色荧光。最大吸收光谱550nm，最大发射波长620nm 丽丝胺罗达明B 200（Lissamine rhodamine B 200）：最大吸收光谱570nm左右，最大发射波长595~600nm。发亮橙色荧光 2 标记方法 影响因素：温度、pH及反应炕中荧光色素和球蛋白比例 温度低，标记时间长；温度高，标记时间长 0~4℃，异硫氰酸荧光素标记抗体搅拌6~12小时，7~9℃搅拌4小时 pH9.0~9.5最适球蛋白标记 pH低，标记慢；pH高，抗体易变性 色素与抗体比例为1：50~1：100 方法： 蛋白溶液A毫克/毫升=B毫升 总蛋白（A×B）=C毫克 2%蛋白溶液容积（C/20）=D毫升 FTTC量（1/50~1/100）=E毫克 碳酸钠缓冲液容积（D/10）=F毫升 加入蛋白溶液中的盐水容积D-（B+F）=G毫升 将一定量（E毫克）的异硫氰酸荧光素溶于2%蛋白溶液的1/10容积的碳酸缓冲液（pH9.5)；溶解FTTC要避免产生气泡。溶解后加入球蛋白溶液中，边加边搅拌，最后加生理盐水调节蛋白质最后浓度至2%，水浴中维持7~9C，慢慢搅拌4小时，FTTC和Ig结合完成。通过葡聚糖凝胶柱过滤，除去未结合的游离荧光素 3 标记抗体的提纯
定位细胞内某种酶或激素的分布和对某些细菌的诊断试剂，去除游离的荧光素或去除过度标记的抗体或蛋白分子 （1）除去游离色素 1）透析法 荧光素分子可通过半透膜，蛋白质大分子不能通过半透膜 将标记的抗体溶液装在透析袋或玻璃纸内，扎紧上口，使其悬浮在流动的自来水中透明5~10分钟 荧光素分子（小）透向浓度低的自来水 中 将其悬浮在装有PBS（pH7.4)的大装杯中，4℃继续透析。每天换透析液（PBS）3~4次，直到无荧光素透至外液，约需5~7天 2）凝胶过滤法 葡聚糖凝胶（Sephadex)吸水后，体积膨胀，颗粒支的网眼打开，把水溶液中应 分子大小的溶质筛开。大分子物质被排在凝胶颗粒之间。小分子物质渗入凝胶颗粒上的网眼中。加入洗脱液，溶液向下推移，最先流出的洗脱溢 含有最大分子的物质，最后流出的是最小分子的物质 凝胶的溶胀与其网状结构疏密有关。不同型号的凝胶见下表：
吸水量：每克凝胶吸水量（/毫升/克）；床体积：凝胶加适量水膨胀后沉降凝胶的体积 凝胶的选用： 除去蛋白质溶液中的盐分子或游离色素，可选用G25或G50 分离免疫球蛋白用G200 层析柱选用： 柱的直径和高度比例为1：20~1：100 比差大，效果好，流速慢 分子大小差别大，选用比差较小的层析柱，如蛋白质脱盐或荧光票房抗体去除游离荧光素，选用比差小的层析柱 凝胶的制备： 根据分离的样品称取凝胶干粉，一般傲视群雄样品容量为柱容积的5~10%比例。慢慢倒入10倍凝胶的草甸沼泽或PBS 室温下浸泡3天或沸水浸泡5小时 轻轻搅拌，室温静置20~30分钟，将上层液倾去 加入PBS重复倾去悬液4~5次，最后制备成稀糊状的凝胶 装柱：凝胶内径和高度比小于0.1，内径2.5厘米，柱床大于25厘米，可达100厘米
在柱下端通一毛细管，并在其外端接一塑料管（管径2毫米内），柱底垫尼龙筛绢或玻璃纤维 装柱前关闭下口，先加PBS 再将已浸泡膨胀的凝胶奚去上清液，使呈稀糊状 沿管壁慢慢边搅动边加柱中，一次加完，不能有气泡或裂隙 加完后再加一些PBS，使凝胶自然下沉，形成背肋新主 柱上口用可调节流速的胶管按PBS下口瓶 打开柱下端的毛细管，用PBS液洗脱，观察洗脱液的流速 加样品： 打开柱上口，当洗脱液液面接近凝胶柱的胶面1厘米时，将柱下端毛细管关闭 加入样品，打开下端毛细管，使样品进入柱内 样品液面接近1厘米时，关闭下端毛细管，加PBS，以PBS洗脱 样品全部进入床柱，显示两人颜色深浅不同的移动带 快速移动带颜色浅，为标记的免疫球蛋白和未标记的蛋白质；慢速移动带颜色深，为游离的荧光素；两带之间无色，为碳酸缓冲液带 一般根据颜色收集第一带洗脱液即标记抗体，大约比样品稀释2倍，分装在青霉素小瓶内，或继续进行二乙氨乙基（Diethyl-aminoethyl-dextran，DEAE）纤维素层析标记抗体收集完后，用PBS洗脱凝胶，直到荣耀素完全 被洗脱掉 从柱中取出凝胶加蒸馏水浸泡，置冰箱备用 DEAE纤维素层析去除过度标记的球蛋白 材料与试剂： 活化的DEAE纤维素液；0.05M PBS（pH8.5)：七水磷酸氢二钠12.868克，一水磷酸氢二钠0.276克，蒸馏水洗10000毫升 洗脱液1（0.05M pH6.4 PB)：七水磷酸氢二钠7.504克，一水磷酸氢二钠9.936克，蒸馏水2000毫升 洗脱液2（0.1M pH6.4 PB)：七水磷酸氢二钠15.008克，一水磷酸氢二钠19.872克，蒸馏水2000毫升 洗脱液3（1N氯化钠 pH7)：氯化钠58.45克，蒸馏水1000毫升 其它：层析柱烧杯和吸管等 生理、装柱、洗脱等与凝胶过滤相似 交换量约每克干重交换剂可交换标记溶液蛋白质量20~50毫克，以少一些为好。加样前以0.005M pH8.4 PBS充分平衡，使DEAE纤维素确定为pH8.4 加经该平衡液充分平衡的样品， 打开下口，用该平衡液洗脱 先由下口流下来的是游离的淡黄色的荧光素和标记低的蛋白质 继续滴下直到无色为止 改用0.05M pH6.4PBS 洗脱，收集黄绿色荧光部分 继续用0.1M pH6.4PBS洗脱，比第一部分荧光颜色深的蛋白质含量较高的第二部分直到无色为止 第三部分为深黄色，蛋白含量高，非特异性部分多。可用0.1N氯化钠 pH7洗脱 第一部分和第二部分是染色用的荧光标记抗体部分，可混合一起。用20%碳蜡或蔗糖浓缩，成为10~20毫克/毫升 4000rpm离心沉淀60分钟 取上清液分状，置冰箱备用 第三部分反复经肝粉反复吸收上特异性成分，也可能使用 （3）组织制剂吸收法纯化抗体（消除非特异性染色） 1）肝粉制备 动物放血，取肝，切成小块，蒸馏水洗3~4次，加等量盐水，在匀浆器制成匀浆，倒入烧杯中，边搅拌边加8倍量的丙酮，离心沉淀，取沉淀物用4倍生理盐水悬浮，冰箱内过夜 离心沉淀的沉淀物再悬浮一定量的生理盐水，用8倍量丙酮处理 重复1~2次，直到上清液无血红蛋白颜色为止 最后加4倍量丙酮，静置后搅拌，弃上清液。重复一次 置漏斗抽滤，尽可能除去丙酮 将沉淀物放在滤纸上置干燥箱内真空低温干燥，分装密封，冰箱保存 2）标记抗体的吸收方法 干粉法：每毫升标记球蛋白溶液加干组织粉100毫克，混匀，室温下放约1小时，离心沉淀（12000~16000rpm）20~30分钟 第二次吸收每毫升标记球蛋白溶液加干组织粉50毫克，离心沉淀，用吸管小心吸取上清液，避免与沉淀物混合。小量分装安瓿中。加0.1%NaN3（叠氮化钠，Sodium azide）防腐，密封冰冻保存 能回收60%，损失一部分溶液 2）湿粉法 将干组织粉用同容积PBS或生理盐水处理，再加荧光抗体液吸收 还可用组织匀浆沉淀物吸收：沉淀物反复用生理盐水洗涤，离心沉淀（15000~16000rpm）30分钟。沉淀物可直接加荧光抗体液吸收非特异性成分。不适于保存 病毒研究，观察培养细胞中的抗原用上法吸收，不能排除非特异性荧光，需用正常培养的同种细胞或培养的同一动物种的细胞吸收。将培养的细胞放-20℃冰冻后融化，待不完全融化，用力摇动，离心沉淀，沉淀物用PBS洗涤1~2次。取细胞沉淀物进行吸收。每毫升荧光抗体液大约用108个细胞 （五）荧光抗体染色法 检查、鉴定、定位和示踪各种抗原或抗体成分 对标本的要求是抗原形态变化尽可能小，不溶解或不变性，原有位置不扩散或不移位 处理标本速度快，温度低，恒冷切片和涂片较理想 抗体溶液pH和反应温度低，孵育时间长 一般37℃需25~60分钟 细致观察或当天不能进行染色标本观察，可在5℃过夜。最好当天观察 1 直接染色法 以荧光抗体直接对标本内的抗原反应 固定：切片或涂片用95%酒精或丙酮固定 冲洗：PBS（pH7.4）充分冲洗 染色：滴加相应荧光抗体液，钭标本放入带有湿纱布的搪瓷盒中，37℃作用30分钟 冲洗：倾去作用液，用PBS充分冲洗 观察：标本晾干或加介质（缓冲甘油液）和盖玻片观察 注意： 首次实验需作对照： 标本加正常未免疫的同种动物的标记球蛋白溶液进行染色，结果阴性； 标本先加同类未标记抗体作用30分钟，PBS冲洗，再加荧光抗体染色，结果阴性 2间接染色法 （1）双层法 固定：丙酮或95%酒精 冲洗：PBS(pH7.4) 第一次作用：被检标本滴加未标记的第一抗体液，并将其放入带有湿纱布的搪瓷盆中37℃作用30分钟 冲洗：倾去作用液，PBS充分冲洗 第二次作用：标本滴加荧光抗体（第二抗体）液，放入湿搪瓷盒中37℃作用30分钟 冲洗：倾去作用液，PBS充分冲洗 观察：标本晾干或加介质和盖玻片观察 首次实验作对照： 标本直接滴加抗免疫球蛋白荧光抗体，结果阴性 标本加同种动物的未免疫血清，PBS冲洗，再加抗免疫球蛋白荧光抗体溶液染色，结果阴性 （2）夹层法 示踪细胞内的免疫球蛋白 固定：丙酮或95%酒精 冲洗：PBS充分冲洗 第一次作用：先滴加与标本内抗体相应的抗原，放湿搪瓷盒37℃30分钟 冲洗：倾去作用液，PBS充分冲洗 第二次作用：加标记的荧光抗体液，放湿搪瓷盒37℃30分钟洗 冲洗：倾去作用液，PBS充分冲洗 观察：标本晾干或加介质加盖玻片观察 3 补体染色法 属间接染色法，可示踪适于补体结合反应的抗原抗体系统 固定：丙酮或95%酒精 冲洗：PBS充分冲洗 第一次作用：滴加每量抗体（用前56℃灭活30分钟）和新鲜豚鼠血清（补体）混合物，放浊搪瓷盒37℃作用30分钟 冲洗：倾去作用液，PBS充分冲洗 第二次作用：滴加抗补体荧光抗体试剂，在温搪瓷盒37℃作用30分钟 冲洗：PBS充分冲洗 观察：标本晾干或加介质和盖玻片观察 4 双重染色法 用不同荧光素分别标记两种特异性抗体，研究同一标本内的两种抗原或抗体成分。常用发黄绿色荧光的异硫氰酸荧光素和发橙红色荧光的四甲基异硫氰酸罗达明 双重染色多用一卡染色法：两种标记抗体适当稀释，混合应用。两种抗体无交叉反应。也可以分两步染色：先用罗达明标记的抗体作用，现加入异硫氰本荧光素标记的抗体 （六）封片介质的制备及染色标本的保存 1 封片介质制备 （1）缓冲甘油（pH8.5) 0.5M碳酸缓冲液（pH9.5)1份，甘油（无荧光）9份 （2）Elvanol缓冲甘油混合剂 Elvanol1份，0.5M碳酸缓冲液（pH9.0)1份 上述两种试剂混合，用磁力搅拌器搅拌6小时，再取1份甘油与两份上述混合液混合。表示周期用磁力搅拌器搅拌6小时，离心沉淀（12000rpm)60分钟。取上清液在密闭容器内，暗处保存 2 染色标本保存 染色后立即在荧光显微镜下观察。在染色当天荧光最强、最明显，如需保存，可放入一个盒子中，用多聚乙烯袋子盖上，在0~5℃保存。用缓冲甘油封的标本，过夜后特异性荧光褪色约30%；1周后褪色50%。用Elanol（聚乙烯醇）封的标本，保存几周后，特异性荧光强度有些减弱。罗达明荧光素在Elvanol中溶解，故用罗这明荧光素标记的抗体不能用Elvanol作封片介质 |
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