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物理化学研究所
筑波大学 理化学研究所(理研)生物资源研究中心iPS细胞高级特性分析开发小组的林洋平小组组长(筑波大学医学医疗系副教授)、玻利维亚大学医学系研究生研究协会(筑波大学研究生院人类综合科学研究科博士课程)、筑波大学医学医疗系西村健副教授、武幸司教授等人的共同研究小组开发了能够更高效、高质量地制作iPS细胞[1]的KLF4蛋白质[2]变体。本研究成果预计将通过比以往更好的新一代重编程(初始化)因子，为使用由患者自身的体细胞制作的iPS细胞的自体移植医疗的实现做出贡献。 此次，联合研究小组在iPS细胞制作时必要的重编程因子之一的KLF4蛋白质中，制作了许多与DNA直接相互作用的氨基酸残基的变体。 从中利用“KLF4 L507A变体(将人KLF4的第507个氨基酸残基亮氨酸置换为丙氨酸)”制备iPS细胞，结果表明可以迅速、高效、高质量的iPS细胞株。 本研究刊登在科学杂志《iScience》在线版( 12月14日:日本时间12月15日)上。
背景 “重编程(初始化)”是通过在不同的位置表达转录因子[3]等重编程因子，将体细胞变为其他理想种类的细胞的技术。 以iPS细胞的开发为代表，作为生命科学、创药、再生医疗的创新技术而发展起来。 重编程因子与DNA沉默(抑制基因表达)的部分等协调结合，作为“先锋因子”开始活跃的转录事件，控制下游基因的表达，以及表观遗传学[4]状态向细胞初始化状态的改变。 为了改善重编程的效率和质量，过去的许多研究都集中在寻找新的替代附加因子、寻找改变表观遗传学状态的因子、改善培养条件和因子的导入方法等方面。 但是，目前的技术中，由于体细胞直接重编程时高质量的iPS细胞产量很少，特别是将患者自身体细胞制作的iPS细胞应用于(自体)移植医疗方面比较晚。 这次，联合研究组的目标是强化现有的重新编程因子本身的功能。 重编程因子中的KLF4(Krüppel-like factor 4)是一种同时具有转录激活域和抑制域的锌指蛋白[5]，广泛用于iPS细胞的制作和其他重编程。 为了改善该KLF4的功能，致力于开发有用的KLF4变体。 研究方法和成果 联合研究小组调查了通过合理设计重编程因子，结合结构生物学、功能生物学的方法，重编程将得到怎样的改善。 首先，着眼于KLF4的DNA结合区域- -锌指区域( ZnF结构域)，从早先报道的晶体结构中发现了19个与DNA相互作用的氨基酸残基(图1 )。 制作将这些氨基酸残基置换为丙氨酸的修饰体群(丙氨酸扫描[6] )，利用逆转录病毒载体[7]将这些修饰体导入小鼠成纤维细胞，制作了iPS细胞。 于是，这些改性体大多与天然型(野生型) KLF4相比，使iPS细胞的制作效率(重编程活性)降低(或消失)，但研究表明，只有“KLF4 L507A变体(将人KLF4的第507位氨基酸残基亮氨酸替换为丙氨酸)”可以提高iPS细胞的生成速度和制作效率(图2 )。  图1 KLF4的ZnF结构域中的氨基酸残基序列用粉红色高亮显示的文字表示制作这次用丙氨酸置换的修饰体的氨基酸残基( 19个)。 这些氨基酸残基与DNA相互作用。 其中，发现只有将ZnF3区域的第507个氨基酸残基亮氨酸( l )置换为丙氨酸( a )的KLF4 L507A变体对iPS细胞的制作有效。  图2使用19个KLF4ZnF变体进行iPS细胞制作实验的结果 进入iPS细胞后，向表达绿色荧光蛋白质( Nanog-GFP )的小鼠纤维母细胞中导入各KLF4变体逆转录病毒载体，制备iPS细胞，分别在第15天、第25天测量了菌落数。 第25天进一步测量了菌落总数的比例。 在KLF4 L507A变体中，可以制作很多iPS细胞。 KLF4 L507A变体对人成纤维细胞也同样提高了iPS细胞的制作效率。 另外，即使使用不插入基因组DNA，对人类细胞显示高感染性，因此被认为在再生医疗中有很高应用性的传感器病毒载体[7]，KLF4 L507A变体同样从小鼠、人类的体细胞两方面来看，也是天然型KLF4。 将制备的人iPS细胞(克隆)株分离后立即进行分析，发现许多细胞中iPS细胞标记的NANOG基因[8]表达不均匀性较低、传感器病毒载体残留引起的RNA表达较低、分化抗性[9]的iPS 结果显示，与天然型KLF4相比，使用KLF4 L507A变体可以制备出更均匀、高质量的iPS细胞。 另外，利用将KLF4的L507部位的氨基酸残基分别置换为20种天然氨基酸的变体制作了iPS细胞，并比较了其制作效率。 结果表明，使用被丙氨酸和甘氨酸等分子体积小的氨基酸残基取代的改性体时，iPS细胞的制作效率较高，L507部位氨基酸残基的分子体积大小与iPS细胞的制作效率呈相反的相关(图3 )。 这表明，L507位点的氨基酸残基会对iPS细胞重新编程中的KLF4功能造成立体障碍。  图3 L507部位氨基酸残基的分子体积与iPS细胞制作效率的关系 使用将KLF4的L507部位的氨基酸残基分别置换成20种天然氨基酸的变体，制作了iPS细胞。 图表的R2表示决定系数(相关函数的平方)，WT(L507 )表示天然型。 然后，分别添加已知能够提高iPS细胞制作效率的几个因子，利用KLF4 L507A变体或天然型KLF4制作了iPS细胞。 结果表明，添加与KLF4同样具有ZnF结构域的转录因子Glis1[10]和Klf5[10]时，提高iPS细胞制作效率的效果会被KLF4 L507A变体所抵消。 这表明，KLF4 L507A变体与添加Glis1和Klf5时具有同样的效果。 另外，ChIP-Seq[11]和RNA-Seq[12]的实验表明，KLF4 L507A变体多与Klf5等部分多能相关基因的启动子[13]和增强子[13]结合，明确了在重编程时，它们的基因表达比天然型因子更强。最后，为了预测KLF4 L507A变体会给KLF4和DNA的结合结构带来什么样的变化，进行了分子动力学模拟分析[14]。 结果发现，在KLF4 L507A变体的蛋白质-DNA复合体中，几个氨基酸残基和DNA之间新形成氢键，发现了存在蛋白质和DNA的结合比天然型KLF4更强化的构造(立体构象)的可能性(图4 )。  图4利用分子动力学模拟预测KLF4ZnF结构域和DNA的复合体结构 蛋白质用丝带表示，DNA用球和棒表示。 L507A变体的团簇4结构(中央)有34%的存在概率，是该变体固有的结构。 认为几种氨基酸残基和DNA之间新形成氢键，蛋白质和DNA的结合比天然型KLF4更为强化。 本研究着眼于用于iPS细胞制作的重编程因子KLF4，从其DNA相互作用的结构知识中探索了变体。 结果，发现了L507A (和L507部位的小氨基酸残基变体)作为将iPS细胞的制备高效化、高质量化的功能强化型变体。 这个改变体被认为可以在与基因组DNA的复合体中形成更坚固的结合状态。 在iPS细胞重新编程时，会更强烈地激活Klf5等多能相关基因的转录。 从以上的分子机制可以看出，iPS细胞制作的期间更短，效率更高。 制作的iPS细胞比以前分化抗性少，质量高的细胞更均匀(图5 )。  图5本研究成果概要 天然型KLF4和这次研究中发现的使用KLF4 L507A变体的iPS细胞的制作实验的不同。 今后的期待 本研究成果是开发了具有比以往的天然型蛋白质更好的重编程能力的“新一代重编程因子”的首次例子。 今后，预计其他重编程因子中也会开发同样的功能增强型变体。 在其延长线上，可以更高效地制备高质量的iPS细胞，因此，期待着为使用患者自身制备的iPS细胞( My iPS细胞)的自体移植医疗的实现做出贡献。 另外，正在募集获得与本研究成果相关的专利许可，希望实现事业化的企业。 补充说明 1.iPS细胞 向包括人类在内的哺乳类体细胞导入极少数因子进行培养后，该细胞将变化为具有分化为各种组织和内脏器官细胞的能力和几乎无限增殖能力的多能干细胞。 该细胞被称为iPS细胞(人工多功能干细胞，induced pluripotent stem cells )。 2.KLF4蛋白质 是制作iPS细胞时使用的重编程因子之一。 除此之外，还涉及初期发生、恒常性维持、癌变等多种生命现象。 结构上包括转录抑制域、转录激活域、锌指域。 3 .转录因子 一组与DNA特异性结合的蛋白质，与DNA上的启动子、增强子区域结合，调节转录。 4 .表观遗传学 广义上是指非遗传性的性状，这里狭义上是指细胞内环境对RNA表达和蛋白质翻译的状态变化，如DNA的甲基化和组蛋白的化学修饰等。 5 .锌指蛋白质 金手指是蛋白质结构域的一种，具有与DNA结合的性质。 锌离子对其结构的稳定化很重要。 6 .丙氨酸扫描 制作将蛋白质的特定氨基酸残基置换为丙氨酸的改性体，调查该氨基酸残基的功能的方法。 由于丙氨酸的侧链只有甲基，分子半径小，不具有极性，因此被广泛用于消除其他氨基酸残基的效果。 7 .逆转录病毒载体，反转录病毒载体 分别是用于向改变逆转录病毒、仙台病毒制作的细胞内导入基因的载体(搬运工)。 逆转录病毒载体稳定地嵌入分裂细胞的基因组DNA中，可以长期表达基因，而传感器病毒载体也可以基因导入非分裂细胞，不能进入基因组DNA，能持续表达数周左右。 8 .纳米基因 是仅在多能干细胞(和生殖细胞的一部分)中高表达的基因，控制着多能干细胞的多能性和自我复制。 在iPS细胞制备实验中，用作制备的iPS细胞的指标(标记)基因。 9 .分化抗性 iPS细胞等干细胞一般具有分化成各种细胞的能力，但由于重编程不充分、长期培养引起的变化等原因，有时会带有难以分化的性质。 这被称为“分化抵抗性”，是阻碍基础研究和再生医疗中分化诱导的主要原因。 10.Glis1、Klf5 都是锌指蛋白，已知可以促进iPS细胞的制作。 Klf5具有类似于Klf4的结构、功能，可以制作iPS细胞来代替KLF4( Nakagawa ET al .，Nature Biotechnology 2008 )。 过去有研究表明，Glis1虽然能促进iPS细胞的效率，但在体细胞和iPS细胞自身中几乎没有表达( Maekawa et al .，Nature 2011 )。 11 .芯片系列 一种全面分析某特定转录因子或组蛋白等DNA结合蛋白在细胞内与DNA的何种序列结合到何种程度的方法。 12.RNA-seq 从细胞内回收RNA，通过全面读取其序列，分析其表达量和表达的基因种类的实验方法。 13 .启动子、增强子 启动子( Promoter )是指参与转录(从DNA合成RNA阶段)开始的基因上游区域的序列。 增强子( Enhancer )更是指周边区域中调节基因转录的序列。 14 .分子动力学模拟分析 预测原子和分子物理运动的计算机模拟方法。 原子和分子在一段时间内被允许相互作用，由此可以预测原子动态发展的状况。 广泛应用于化学物理学、材料科学、生物分子的建模。 联合研究小组 理化学研究所生物资源研究中心iPS细胞高级特性分析开发小组 队长林洋平 (筑波大学医学医疗系副教授[合作研究生院]、筑波大学全球教育院生命创新学位计划副教授[合作研究生院] ) 研究生研究协会玻利索瓦·叶甫盖尼亚( Borisova Evgeniia ) (筑波大学研究生院人类综合科学研究科博士课程) 技术人员(研究当时)安瑜利 研修生(研究当时)髙见美帆(高美穗) (筑波大学研究生院人类综合科学研究科硕士课程) 研修生(研究当时)金百合(金玉莉) (筑波大学研究生院人类综合科学研究科硕士课程) 研修生丹森( Dang Song ) (筑波大学研究生院人类综合科学研究科博士课程) 开发研究员髙真美 研修生(研究当时)多里安·勒克( Dorian Luijkx ) (荷兰乌得勒支大学研究生硕士课程) 筑波大学医学医疗系 基因控制学研究室 教授久武幸司 副教授西村健 研究生相泽志穗 解剖学发生学研究室 助教久野朗广 (全球教育院人类生物学学位计划) 精密制造业开发研究中心 中心主任教授佐藤孝明 客座副教授杉原英志 (藤田医科大学研究支援推进本部共同利用研究设备支援中心基因组解析室副教授) 高能加速器研究机构物质结构科学研究所结构生物学研究中心 特任副教授(研究当时)汤本史明(本本文明) 东京大学研究生院农学生命科学研究科应用生命工程专业生物分子工程讲座 准教授寺田透 研究支援 本研究是日本医疗研究开发机构( AMED )创药等生命科学研究支援基础事业创药等尖端技术支援基础平台( BINDS )的课题“重编程因子变异体在DNA相互作用中的分子动力学模拟”(课题编号JP21am0101107 (支援编号1907 ) 日本学术新兴会( JSPS )科学研究费补助金研究活动启动支援“从KLF4DNA结合部位氨基酸残基的功能分析到改良重编程因子的开发(研究代表者:林洋平)”(课题编号JP16H06662 )，该年轻研究( a ) 《修复伴有染色体异常的疾病特异性iPS细胞的“染色体编辑法”的开发(研究代表者:林洋平)》(课题编号JP17H05063 )、基础研究( b )“iPS细胞诱导过程中基于Klf4的细胞形态和细胞功能的重新编程机构(研究代表者:久武幸司)” “iPS细胞诱导中以Klf4为中心的动态基因组转录控制的分子机构(研究代表者:西村健)”(课题编号JP19H03203 )、文部科学省“纳米技术平台事业”(课题编号JPMXP09 S20NM0001 )、公益财团法人武田科学 另外，鲍里索夫·盖尼亚在本研究实施期间还获得了大冢敏美育英奖学金。 原论文信息 Evgeniia Borisova, Ken Nishimura, Yuri An, Miho Takami, Jingyue Li, Dan Song, Mami Matsuo-Takasaki, Dorian Luijkx, Shiho Aizawa, Akihiro Kuno, Eiji Sugihara, Taka-aki Sato, Fumiaki Yumoto, Tohru Terada, Koji Hisatake, and Yohei Hayashi, "Structurally-discovered KLF4 variants accelerate and stabilize reprogramming to pluripotency", iScience, 10.1016/j.isci.2021.103525  林 洋平 玻利索瓦·叶卡尼亚( Evgeniia Borisova ) 西村 健 久武 幸司新闻负责人
理化学研究所宣传室新闻负责人 筑波大学宣传室
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