基于网络药理学的四逆散保肝作用机制研究

廿氏春秋 2021-12-20

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摘要：目的基于网络药理学探讨四逆散治疗慢性肝炎、脂肪肝与肝癌的物质基础和保肝的作用机制，同时揭示四逆散治疗肝病“异病同治”的分子机制。方法利用TCMSP、CTD、Genecards、Omim等数据库与相关文献检索四逆散有效化学成分、靶点和慢性肝炎、脂肪肝、肝癌疾病靶点；利用TBtools软件获取四逆散保肝作用的潜在靶点；利用Cytoscape 3.7.2软件构建“有效化学成分-靶点”网络与潜在靶点蛋白互作网络；利用Uniprot数据库对潜在靶点进行注释；利用David数据库对潜在靶点进行基因本体（GO）生物功能与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。结果共获取四逆散有效化学成分137个、靶点223个，慢性肝炎靶点478个，脂肪肝靶点17 277个，肝癌靶点16 930个，四逆散保肝作用的潜在靶点30个。GO生物功能与KEGG通路富集分析显示潜在靶点共涉及178个生物过程，参与51条信号通路，排名前20的通路中与肝病相关的有9条。结论四逆散可能是通过调控IL-6、VEGFA、EGFR、PPARG、CASP3等潜在靶点和HIF-1、TNF、PI3K-Akt等相关信号通路，发挥抗炎、抗氧化应激、抑制细胞凋亡等功能，从而对肝脏起到保护作用。

四逆散是由柴胡、白芍、枳实、甘草4味中药组成的方剂，首载于《伤寒论》。本方原治阳郁厥逆证，《伤寒论·辨少阴病脉证并治》中记载“少阴病，四逆，其人或咳，或悸，或小便不利，或腹中痛，或泄利下重者，四逆散主之”，后经世代医家传承总结，多用作疏肝健脾的基础方，附方亦有柴胡疏肝散、枳实芍药散等。四逆散方中柴胡疏肝解郁、升发阳气，为君；白芍敛阴养血、调达肝气，为臣；枳实理气解郁、泄热破结，为佐；甘草调和诸药、和中健脾，为使，四药合用，共奏疏肝健脾之功。四逆散临床多用于治疗消化系统、肝胆、妇科、泌尿系男科、儿科、神经系统、内分泌、外科等疾病，疗效确切，效果显著^[1]。现代药理学研究表明，四逆散具有改善肝纤维化程度、降低血清内毒素、调节基质降解、抑制肝癌细胞增殖等作用，在治疗脂肪肝、慢性肝炎、肝癌等肝脏疾病过程中，对肝脏具有保护作用^[2-5]。目前肝病致死人数在世界死亡总人数中约占7.9%^[6]，由于现有治疗方法效果不佳，临床中仍需新型有效的肝病防治药物，保肝药物的研究与开发具有广阔的科研和应用价值。

近年来，人们引入了网络药理学系统评估中药的药理作用，进而探索中药发挥药效的分子机制。通过对分子间相互作用网络和相关数据等进行可视化分析，研究人员可以全面系统地识别中药的靶蛋白并评估其对疾病的影响^[7-9]。吴丹等^[10]采用网络药理学方法探究了逍遥散治疗抑郁症与糖尿病“异病同治”的作用机制；何信用等^[11]应用网络药理学探究了黄连解毒汤治疗动脉粥样硬化的潜在分子机制；郑罗棋等^[12]通过网络药理学探究了吴茱萸致毒性的潜在分子机制。因此，基于网络的筛选在中药的二次开发和机制预测方面具有重要意义。本研究以目前已鉴定的四逆散中药物有效活性成分和潜在的肝病靶点为基础，进行四逆散的网络药理学研究，探究四逆散保肝的作用机制，旨为中医异病同治理论提供有力的科学依据。

1 材料与方法

1.1 四逆散有效化学成分与靶点的收集

在TCMSP（http:///tcmsp.php）数据库中检索四逆散方剂组成药物柴胡、白芍、枳实、甘草的有效化学成分及成分相应靶点，筛选条件为“口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%”“药物相似性（drug likeness，DL）≥0.18”，查阅文献，对四逆散有效成分和靶点进行补充。

1.2 四逆散“化学成分-靶点”网络的构建

1.3 疾病靶点的收集

在CTD（http://）、Genecards（https:// www.genecards.org）、Omim（https://）数据库中检索关键词“fatty liver”“chronic hepatitis”“liver cancer”以收集脂肪肝、慢性肝炎和肝癌疾病靶点。在CTD与Genecards数据库检索结果中分别选择推理分数（inference score）＞20、关联分数（relevance score）＞20的疾病靶点。查阅文献，对疾病靶点进行补充。

1.4 四逆散保肝作用潜在靶点的处理

利用TBtools软件对四逆散靶点与疾病靶点进行交集比对，将四逆散治疗脂肪肝、慢性肝炎、肝癌3种疾病的靶点作为四逆散保肝作用的潜在靶点。利用Uniprot数据库（https://www.）对潜在靶点进行注释。将保肝作用潜在靶点信息导入STRING数据库（https://），得到保肝作用潜在靶点蛋白互作网络（PPI）信息表，进一步将表中数据导入Cytoscape软件中，构建潜在靶点PPI网络，并进行拓扑学分析。该网络中节点大小与度值呈正相关，节点之间连线的颜色深浅、粗细程度与结合分数呈正相关。

1.5 基因本体（GO）生物功能与百科全书基因组（KEGG）通路富集分析

将保肝作用潜在靶点信息导入Divid数据库（https://david.），分别勾选生物过程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）、细胞组成（cellularcomponent，CC）、KEGG信号通路（KEGG pathways），得到潜在靶点的GO生物功能与KEGG通路富集分析结果。

2 结果

2.1 四逆散有效成分

如表1所示，TCMSP数据库和文献共收集整理四逆散有效成分137个，包括来自柴胡17个、白芍13个、枳实22个、甘草92个，其中山柰酚（kaempferol）为柴胡、白芍、甘草共有有效成分，异鼠李素（isorhamnetin）、槲皮素（quercetin）为柴胡、甘草共有有效成分，白桦脂酸（mairin）、谷甾醇（sitosterol）为白芍、甘草共有有效成分，柚皮素（naringenin）为枳实、甘草共有有效成分。

2.2 四逆散“有效成分-靶点”网络

经数据库检索和文献补充，共获取四逆散靶点223个，包括柴胡94个、白芍44个、枳实52个、甘草105个。四逆散“有效化学成分-靶点”网络见图1。该网络中共有1 783条边，336个节点，包括来自有效成分节点113个、四逆散靶点节点223个，

2.3 四逆散保肝作用的潜在靶点

经数据库检索和文献补充，共获取慢性肝炎靶点478个、脂肪肝靶点17277个、肝癌靶点16 930个。利用TBtools软件将四逆散靶点与疾病靶点进行交集比对，如图2所示，得到四逆散保肝作用的潜在靶点30个。四逆散保肝作用潜在靶点信息见表3。

2.4 四逆散保肝作用潜在靶点的PPI网络

进一步对该网络进行拓扑学分析，如图3所示，该网络BC为0.02、CCL为0.62、CCF为0.73、NC为14.45、度值中位数为12，网络中未出现孤立节点，显示良好的连通性，度值大于中位数且排名前5的潜在靶点依次为白细胞介素-6（IL-6）、血管内皮生长因子（VEGFA）、表皮生长因子受体（EGFR）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARG）、半胱氨酸蛋白酶3（CASP3）。

2.5 GO生物功能与KEGG通路富集分析

经David数据库分析，GO生物功能富集结果显示，保肝作用潜在靶点总计涉及178个生物过程（P＜0.05），属于BP的有126个，包括对药物的反应、凋亡过程的负调控、肝再生、基因表达的正调控、细胞对IL-1的反应等；属于CC的有19个，包括胞质溶胶、细胞外空间、细胞内膜结合细胞器、细胞质、脂筏等；属于MF的有33个，包括酶结合、转录因子结合、相同的蛋白质结合、蛋白质异二聚活性、蛋白质复合物结合等。GO生物功能富集结果排名前20的条目见表4。

3 讨论

肝脏在代谢、排毒、消化和维持体内平衡方面起着至关重要的作用。我国大约有3亿人受各类肝病困扰，针对肝病的预防与治疗一直是公共卫生领域的热门话题^[13]。慢性肝炎、脂肪肝、肝癌是3个具有代表性的肝脏疾病，共同表现为产生慢性炎症，肝伤口愈合反应异常，出现肝纤维化，进而导致肝细胞损伤、肝脏正常功能失调，最终肝功能衰竭^[14]。中医理论认为脂肪肝、慢性肝炎、肝癌病位在肝，且与脾脏密不可分，病因包括饮食不节、情志失调、外感湿热疫毒等，日久则伤及肝脾，以致肝失疏泄、脾失健运、痰浊内生、阻滞气机、痰瘀互结而发病，病机以肝郁脾虚为主，故疏肝健脾、透邪解郁之法在疾病的治疗过程中尤为重要^[15-17]。四逆散中柴胡升清，枳实降浊，君臣互用，肝脾调和、气机和畅；白芍补阴，兼以敛脾，与甘草合用，酸甘化阴、柔肝滋脾；四药并用，既可疏肝健脾，亦可透邪解郁，达到扶正祛邪的目的^[18]，这在理论上解释了四逆散在临床上用于脂肪肝、慢性肝炎、肝癌“异病同治”的原因。

本研究利用“有效成分-靶点”网络分析了四逆散中柴胡、白芍、枳实、甘草的有效成分，进一步研究了化学成分与靶点之间的相互作用关系。该网络中度值排名前3位的化学成分依次为槲皮素、山柰酚、异鼠李素，同属黄酮类。槲皮素与异鼠李素是柴胡、甘草中的有效成分，具有多种生物和药理活性，包括抗炎、抗氧化应激、抗细胞凋亡等^[19-20]。Yang等^[21]研究显示，槲皮素可降低血清转氨酶水平，减少2型糖尿病诱导的肝脏组织学改变，恢复肝脏中关键酶水平，减少db/db小鼠肝脏中的脂质蓄积，促进非酒精性脂肪肝的恢复。此外，槲皮素有强大的活性氧（ROS）清洗功能，可以降低中、高浓度ROS产生的氧化应激反应，抑制细胞凋亡或坏死，减缓肝脏肿瘤细胞的增殖速度^[20,22]。Wu等^[23]研究发现槲皮素可下调Janus激酶2（JAK2）和信号传导和转录激活剂3（STAT3）水平，干扰LM3细胞的增殖和细胞周期分布，诱导细胞凋亡，抑制肝细胞癌的增殖分化。异鼠李素可以通过诱导异鼠李素可以显著阻止四氯化碳（CCl₄）诱导的血清丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶水平的升高，降低磷酸化Smad蛋白（Smad3）、转化生长因子-β1（TGF-β1）、组蛋白脱乙酰基酶8（α-SMA）和纤溶酶原激活物抑制剂1（PAI-1）表达，从而预防肝纤维化^[19]。山柰酚为柴胡、白芍、甘草的有效化学成分，能够激活活化素受体样激酶（ALK5）ATP结合口袋的靶向结合，抑制胶原蛋白的合成和肝星状细胞的活化，下调Smad2/3磷酸化水平，显著改善肝纤维化^[26]。此外，研究表明，食用富含山柰酚的食物可以降低罹患肝癌的风险，与抑制细胞凋亡、下调上皮-间质（EMT）相关标记和P13K-PKB信号通路等作用机制有关^[27]。山柰酚还可以通过抑制AKT、激活某些过氧化物酶体增殖物激活受体，从而发挥降低体内三酰甘油的作用^[28]。

本研究在对“有效成分-靶点”和保肝作用潜在靶点PPI网络的分析中，发现PPARG在两个网络中的度值均位于前5位；IL-6在潜在靶点PPI网络中的度值位于第1位。PPARG又名PPARγ，在肝脏中，PPARG的表达可以控制脂肪酸氧化、脂蛋白代谢、糖异生和酮体生物合成^[29]。PPARG具有一个大的Y型配体结合袋，可与配体灵活地相互作用。Wei等^[30]通过对肝细胞PPARG缺乏小鼠的研究，证明PPARG配体罗格列酮可通过PPARG依赖性方式抑制核因子-κB（NF-κB）/TNF-α信号通路来改善肝脏的纤维化程度。PPARG可以通过多种途径抑制肝脏肿瘤的进展，德氮吡格-5620（TNBG-5620）可以诱导PPARG基因和蛋白质发生改变，通过激活PPARG和下调增殖细胞核抗原（PCNA），发挥抗肝癌作用^[31]。在肝病的防治领域，IL-6的应用始终存在争议。有学者认为，IL-6是肝脏再生和防御各种肝脏疾病病原体的关键调节剂，IL-6可以促进细胞增殖、血管新生和代谢，并抑制细胞凋亡和氧化应激^[32]。也有学者认为，IL-6的选择性抑制对肝Scheller等^[34]通过对IL-6及其配体的研究，认为IL-6的再生或抗炎作用是通过经典信号传导介导的，而IL-6的促炎反应则是由反信号传导介导的。

为了说明四逆散保肝作用潜在靶点的生物功能和作用机制，本研究进行了GO生物功能和KEGG通路富集分析，发现潜在靶点的生物功能主要集中在对药物的反应、酶结合、凋亡过程的负调控、肝再生、基因表达的正调控、细胞对肿瘤坏死因子的反应、类黄酮代谢过程等方面。通过对获得通路的分析，发现保肝作用潜在靶点主要富集在乙肝、癌症通路、HIF-1信号通路、TNF信号通路、细胞凋亡、Toll样受体信号通路、癌症中蛋白聚糖、NOD样受体信号通路、PI3K-Akt信号通路等与肝病相关的信号通路中。HIF-1是缺氧反应的中心调节剂，也是血管生成、炎症和代谢的关键调控因子，参与一系列肝脏病理学的发展，包括肝纤维化、免疫系统的激活、肝癌等^[35]。环腺苷酸依赖性转录因子ATF-3的缺乏会激活HIF-1信号通路，促进肝细胞凋亡和炎症反应；肝细胞中HIF-1α基因的敲除对肝纤维化具有保护作用^[36-37]。TNF在炎症、细胞增殖、凋亡中起着重要作用^[38]，根据其结构与功能分为Liu等^[41]研究证明通过激活NF-κB信号通路可以防止TNF-α诱导的肝损伤。PI3K-AKT通路可直接或间接调控重要的表观遗传修饰因子，参与PI3K的致癌过程，该途径在各种类型的癌症中涉及多种生物学过程，在癌症中的异常激活将导致细胞周期异常进展、黏附、运动改变、抑制细胞凋亡和诱导血管生成^[41-45]。

脂肪肝、慢性肝炎、肝癌的疾病进展与免疫炎症、氧化应激和细胞凋亡等有关^[46-48]。研究表明，TNF-α、IL-6等炎症介质的表达，孕烷X受体（PXR）、PPARα等核因子的改变，caspase酶的激活，促炎细胞因子级联反应、免疫反应的出现，人体细胞原癌基因c-myc、Pokemom的激活，抑癌基因NOR1、micro-RNA-26a的抑制等会导致肝纤维化，引起肝细胞损伤和肝脏正常功能失调，最终导致肝功能衰竭^[14]。这与本研究预测结果中的免疫炎症、氧化应激、细胞凋亡和HIF-1、TNF、PI3K-Akt等相关信号通路具有一致性。现代药理学研究表明，四逆散能够促进Bcl-2相关细胞死亡激动剂表达，抑制Bax蛋白表达，下调CASP3、TNF-α水平，发挥抗肝损伤作用^[49]；诱导降低大鼠血清中TGF-β1水平，阻断JAK-STAT3信号通路，促进肝星状细胞（HSC）凋亡，降低肝组织中Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ型胶原水平，下调金属蛋白酶组织抑制剂1（TIMP-1）和TGF-β1水平，从而治疗肝纤维化^[4,51-53]；通过调节MAPKs/NF-κB途径抑制脂多糖致Raw264.7的细胞炎症，发挥抗炎作用^[54]；通过ROS依赖的Sirt1-p53凋亡途径，抑制肝癌细胞HepG2生长^[55]。以上对四逆散的实验研究在一定程度上验证了四逆散基于中医理论“异病同治”模式下治疗脂肪肝、慢性肝炎、肝癌的分子机制，但四逆散治疗脂肪肝、肝癌与慢性肝炎的分子机制是否涉及肝再生、类黄酮代谢过程、Toll样受体、NOD样受体信号通路等仍需进一步的体内外实验进行验证。