摘 要:目的 探讨天麻对小鼠睡眠的促进作用及其对中枢多巴胺(DA)系统的影响,并进一步研究天麻有效成分天麻素通过影响DA通路发挥作用的机制。方法 小鼠随机分为对照组、天麻组、橄榄油组、天麻-橄榄油组及阳性对照艾司唑仑组,每组10只,分别ig给予生理盐水、天麻、橄榄油、天麻-橄榄油和艾司唑仑,连续给药20 d。各组小鼠分别在第7、20天给药30~40 min后ip最大阈下剂量戊巴比妥钠(35 mg/kg),测定睡眠发生率;分别在第8天及第21天ip最小阈上剂量戊巴比妥钠(50 mg/kg),检测小鼠睡眠潜伏期和睡眠时长;采用ELISA法测定天麻对小鼠脑组织DA水平的影响;采用qRT-PCR法检测天麻对DA受体各亚型表达的影响;构建DA受体D1、D2诱导表达稳定细胞株,Westernblotting法检测ERK通路相关蛋白的表达水平。结果 与对照组比较,天麻给药20 d后小鼠睡眠潜伏期显著缩短,睡眠发生率提高,睡眠时长延长,中枢DA水平显著提高,DA受体各亚型的表达水平显著上调。同时,天麻中有效成分天麻素可激活DA受体D2而不是D1介导的信号通路。结论 天麻可能通过上调中枢DA系统活性进而调控睡眠,天麻中有效成分天麻素可能通过D2介导的信号通路发挥作用。 失眠已经成为影响现代人健康的重要问题之一,据调查,我国约47.2%的老年人存在不同形式的睡眠障碍,并且这一问题呈现出逐年年轻化的趋势[1]。失眠不仅会诱导情绪的过度兴奋(焦虑、反叛和心境恶劣的人格特质),而且与精神疾病高度共存,是产生抑郁和自杀倾向的重要诱导因素[2-3]。目前临床治疗失眠的药物主要包括苯二氮䓬类药物(三唑仑、艾司唑仑、硝基安定等)、褪黑素受体激动剂和具有催眠效果的抗抑郁药物[4]。 苯二氮䓬类药物主要与苯二氮受体结合发挥作用,可增强γ-氨基丁酸(GABA)能神经的功能,促进Cl离子内流,使神经细胞膜超极化。由于苯二氮䓬类药物弥散性地抑制中枢神经系统,常带来戒断综合症和白天残留效应等副作用[4],而褪黑素受体激动剂如褪黑素容易产生耐药性和药物依赖[5]。近年来,神经解剖学、药理学和分子生物学研究发现多巴胺(DA)能神经元与睡眠觉醒脑区间有着广泛的纤维联系,临床常用的以DA受体为靶点的抗精神病药物都具有良好的镇静安神作用,如DA受体D1拮抗剂氯氮平以及FDA批准的2个DA受体 本研究利用经典的小鼠睡眠实验探讨天麻对睡眠的促进作用及其对中枢DA系统的影响,并进一步研究天麻有效成分天麻素通过影响DA通路发挥作用的机制,为研究天麻对中枢神经系统的影响提供实验依据。 1 材料 1.1 动物与细胞 SPF级昆明种小鼠50只,雌雄各半,体质量(20±2)g,购自昆明医科大学SPF级实验动物中心,实验动物生产许可证号SCXK(滇)K2015-0002,饲养于昆明理工大学动物实验中心,饲养室温度为(25.0±0.5)℃,采用全价营养颗粒鼠饲料,动物自由取食、饮水。源自人胚胎肾细胞的Flp-inTM T-RexTM HEK293细胞购自Invitrogen公司。 1.2 药品与试剂 天麻于2018年4月25日购自云南省昭通市药材市场,为2017年12月采收,经昆明理工大学生科院郝倩博士鉴定为昭通乌天麻Gastrodia elata Bl. f. glauca S. Chow.的干燥块茎;戊巴比妥钠(山东西亚化学股份有限公司,批号F074);艾司唑仑片(常州四药制药有限公司,批号20170812);特级初榨橄榄油(Olitalia公司);生理盐水(昆明南疆制药有限公司);第一链cDNA合成试剂盒(Thermo Fisher Scientific公司,);qRT-PCR DNA荧光染料(Roche公司);小鼠多巴胺ELISA试剂盒(Mlbio公司);胎 1.3 仪器 高速离心机(Labogene公司);微量移液枪(Gilson公司);通用手术器械(上海医疗器械有限公司);BX-50奥林巴斯显微镜(Olympus公司);电子天平(Ohaus公司);酶标仪(Bmglabtec公司);实时荧光定量PCR(qRT-PCR)仪(Roche公司);DYY-7C型电泳仪(北京六一仪器有限公司)。 2 方法 2.1 药品配制 称取天麻粉(全天麻烘干超微粉碎制得)0.24 g混匀于4 mL生理盐水中制成0.6 g/mL混悬液待用。称取天麻粉0.24 g,加入1 mL橄榄油和3 mL生理盐水,制成含25%橄榄油的天麻粉混悬液,备用。称取0.4 mg艾司唑仑粉末,加入4 mL生理盐水制成0.1 mg/mL的混悬液备用。取1 mL橄榄油与3 mL生理盐水,使用时混匀吸取。 2.2 分组与给药 将50只小鼠随机分为5组,分别为对照组、天麻组、橄榄油组、天麻-橄榄油组及阳性对照艾司唑仑组,每组10只,雌雄各半。对照组小鼠每只ig给予生理盐水0.4 mL,天麻组小鼠ig给予溶于生理盐水的天麻粉1.2 g/kg[13],橄榄油组小鼠每只ig给予25%橄榄油生理盐水混悬液0.4 mL,天麻-橄榄油组小鼠每只ig给予含25%橄榄油的天麻粉混悬液1.2 g/kg,艾司唑仑组小鼠ig给予2 mg/kg的艾司唑仑,连续给药20 d。各组小鼠分别在第7、20天给药30~40 min后ip最大阈下剂量戊巴比妥钠(35 mg/kg),测定睡眠发生率(以翻正反射消失为进入睡眠);分别在第8天给药30~40 min后及第21天ip最小阈上剂量戊巴比妥钠(50mg/kg),检测小鼠睡眠潜伏期(从注射戊巴比妥钠到小鼠翻正反射消失的时间段)和睡眠时长(翻正反射消失到翻正反射恢复的时间段)。 2.3 qRT-PCR检测多巴胺受体各亚型mRNA表达 利用相关软件设计qRT-PCR引物并利用NCBI的Primer Blast功能验证引物特异性,引物序列见表1。连续给药20 d,测定小鼠各项睡眠指标后颈椎脱臼法处死小鼠并取全脑匀浆,称取全脑匀浆约0.1 g,用1 mL Trizol裂解,提取总RNA并及时反转录成cDNA用于qRT-PCR。以cDNA为模板配制成20 µL的反应体系,使用RocheLight Cycler96实时荧光定量PCR仪进行测定,具体反应条件为: 95 ℃、10 min预变性,95 ℃、10 s,60 ℃、10 s,72 ℃、15 s,共40个循环。采用 2.4 ELISA法检测小鼠脑组织DA水平 颈椎脱臼法处死小鼠并称取约0.1 g的小鼠全脑于0.8 mL 1×PBS中快速混匀,并充分涡旋使递质溶出,5 000×g离心10 min,取上清按照试剂盒说明书采用ELISA法检测DA水平。 2.5 Western blotting法检测DA受体D1、D2诱导表达稳定细胞株ERK通路相关蛋白的表达 利用Flp-in T-Rex HEK293®系统,将含有D1和D2编码序列的诱导表达载体pCDNA5/FRT/TO- VSV-GluR5-D1/D2与可以在哺乳动物细胞中过表达整合酶的pOG44载体共转染Flp-in T-Rex HEK293细胞,并用潮霉素筛选,得到由多西环素(DOX)诱导表达多巴胺受体D1和D2的稳定细胞株。 用DOX以终质量浓度10 ng/mL诱导上述稳定株24 h,血清饥饿12 h,分别使用0.001、0.100、10.000 nmol/L的天麻素分别处理D1和D2细胞(分别都以空载体细胞为阴性对照)各5 min,以DA受体激动剂多巴胺盐酸盐(100 nmol/L)作为阳性对照。在上述处理过的细胞中加入含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液,充分裂解细胞,蛋白定量,与SDS上样缓冲液混匀,利用SDS-PAGE凝胶电泳进行分离并转移到PVDF膜上,以5%脱脂牛奶封闭。用一抗(VSV、ERK1/2和pERK1/2抗体)分别孵育2 h。TBST/T洗膜3次,相应二抗孵育1 h。TBST/T洗膜3次。最后配制化学发光底物,并在化学发光仪上对靶蛋白条带进行曝光显影。 2.6 统计学方法 应用统计学软件SPSS Statistics 22.0进行数据分析,组内比较采用t检验,组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)。 3 结果 3.1 天麻对小鼠睡眠的影响 3.2 天麻对小鼠脑内神经递质DA水平的影响 结果显示,与对照组比较,天麻组和天麻-橄榄油组小鼠脑内DA水平均显著提高,天麻-橄榄油组DA水平上调幅度更为明显(P<0.01、0.001,图2)。天麻-橄榄油组相对于橄榄油组小鼠脑内DA含量提高约36%,高于天麻组相对于对照组的提高幅度(约25%)。阳性对照艾司唑仑组小鼠脑内DA水平显著高于对照组(P<0.001,图2)。 3.3 天麻对DA受体各亚型表达的影响 采用qRT-PCR法检测小鼠脑内D1~D5的表达。结果显示,与对照组比较,天麻显著提高了小鼠大脑中枢各个亚型DA受体的表达(图3),且其效果优于艾司唑仑。同时,各组小鼠各个亚型DA受体的上调趋势一致。提示天麻在促进小鼠睡眠过程中,D1样受体和D2样受体可能均参与了调控,而天麻水溶性成分(如天麻素)可能扮演了更重要的角色。 3.4 天麻素对ERK通路相关蛋白表达的影响 为观察天麻素对DA受体介导的通路的作用,采用Westwenblotting法检测ERK通路的效应蛋白ERK1/2及p-ERK1/2表达水平。结果(图4)显示,与对照组比较,天麻素可以通过DA受体D2激活ERK1/2,显著提高p-ERK1/2水平,效果与多巴胺盐酸盐相当,但剂量依赖不明显。而天麻素对D1受体介导的ERK1/2通路激活作用并不明显。提示天麻素可能主要通过D2受体激活ERK1/2通路发挥睡眠调控作用。 4 讨论 中枢的DA系统是调控睡眠和觉醒的重要组分[14]。D1和D2都可以被DA激活,从而激活下游信号通路,其中ERK1/2是D1和D2通路的重要分子标记[15-16]。激动剂可通过D1 或D2激活效应蛋白ERK1/2,提高ERK1/2磷酸化水平[15-16]。ERK1/2属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,能在生理和病理条件下参与中枢神经系统的功能调节。本研究发现,天麻能够提高小鼠中枢神经递质DA水平,并上调各个亚型DA受体的表达,发挥促进睡眠的作用,这些作用可能部分由天麻中水溶性成分天麻素通过D2激活ERK1/2通路来实现。 -橄榄油组小鼠的睡眠潜伏期显著缩短,天麻组小鼠睡眠时长显著增加,提示天麻中脂溶性成分可能具有加速入眠的功能,而水溶性成分可能具有延长睡眠时间的作用。 失眠作为一种原发性或继发性睡眠障碍,其发病机制与神经递质紊乱、睡眠相关受体表达失常、生活压力过大等一系列因素相关。DA作为哺乳动物脑内含量最多的神经递质之一,参与了机体睡眠-觉醒、运动、认知行为和正性强化等多项功能的调控。郝晋东等[18]发现天麻素可提高大鼠纹状体多巴胺含量,庞宇涵等[19]发现人参益智胶囊可提高小鼠脑内去甲肾上腺素(NE)、DA、5-羟色胺(5-HT)含量,改善小鼠的睡眠。本研究结果表明,天麻可显著提高小鼠脑部DA水平,同时发现DA受体各亚型的表达量也有显著提高,因为中脑边缘DA系统具有调控兴奋和镇静的双重作用[20],且哺乳动物的睡眠还受到γ-氨基丁酸A型受体(GABAa)、Melatonin、5-HT、Orexin等多种受体的调控。本研究初步证明天麻可提高中枢DA系统的活力,但其不同于褪黑素系统发挥的快速促睡眠功效[21],天麻中的有效成分能够以一个较为缓慢的过程发挥促睡眠作用。更为确切的调控机制还需深入研究。实验中发现橄榄油也可提高小鼠脑内DA水平和DA受体表达量,推测这可能是橄榄油在抗衰老与益智健脑方面作用的机制之一[22]。 参考文献(略) 来 源:胡鹏程,王 进,李墨香,刘 莹,郭晓汐,郝 倩,安 输,徐天瑞,杨 洋. 天麻改善小鼠睡眠作用及其机制研究 [J]. 中草药, 2019, 50(13):3140-3146. |
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