|
生物学研究大抵有两种方向，一是将生物学过程以及功能在体内的环境中进行研究，越体内越接近对于该过程在真正的生物学上下文环境中的解析；另一是将生物学过程和功能在体外进行重组，一个步骤、一个步骤地对这些过程进行还原，能够接近体内的特征同时对此步骤的研究也将变得单纯，因为体外重组对生物学过程每个步骤的解读都非常直观，不会受到体内复杂微环境的影响。 2017年，诺贝尔生理或医学奖授予了生物钟（Circadian clocks）与其内在调控机理。生物钟提供了细胞内对于时间的表征，通过控制基因表达的时间来指示白天与黑夜、日出与日落。在蓝藻中，生物钟计时是通过一个振荡器实现的，主要是由三个Kai（Kai在日语中的意思为“循环”）蛋白KaiA、KaiB以及KaiC以及两个组氨酸激酶SasA和CikA传递时间信息，以调节更下游的转录因子RpaA对与输出蛋白表达的调控【1-3】。在复杂的细胞上下文环境中，想要对昼夜节律时钟调控基因表达的具体机制进行探究是很有挑战性的一件事。为此，美国加州大学Andy LiWang研究组与Carrie L. Partch研究组在Science合作发文题为Reconstitution of an intact clock reveals mechanisms of circadian timekeeping，构建了一个具有荧光输出的体外重组生物钟，鉴定发现了SasA以及CikA在生物钟的振荡中的重要作用，对先前认为生物钟只依赖于Kai蛋白的观点发起了挑战。 为了重新组建一个体外完整的生物钟，作者们将生物钟核心振荡器元件以及信号转导的组分子以特定的浓度在体外进行组装，从而可以在体外对蓝藻的生物钟调节机制进行进一步地研究。因此，除了KaiA、KaiB以及KaiC外，作者们在这个体外时钟中加入了SasA以及CikA、RpaA以及一个带了clock控制的启动子双链DNA，并且证明这些组分足以开启时间维持以及下游事件的基础调控网络。 为了对该体外时钟中的蛋白组分相互作用进行检测，作者们在每个组分上加上了荧光探针【4】，并通过荧光各向异性（Fluorescence anisotropy，FA）的方式对这些组分在体外时钟中的行为进行检测（图1），另外作者们使用质子核磁共振成像实时监测KaiC的腺苷三磷酸酶活性。作者们确认，他们在体外重建了一个完整的具有时间控制节奏的DNA结合时钟，这种体外时钟可以连续几天自动振荡并实时监测每个组分，揭示从计时器到RpaA与DNA结合的大分子组装的形成和阶段。 图1 体外重组时钟模型 先前的研究表明，蓝藻昼夜节律的转录输出是基于两个传感器组氨酸激酶的拮抗活性：SasA是一种依赖于KaiC的激酶，在黄昏时磷酸化RpaA以刺激DNA结合并激活基因表达，而CikA被刺激作为一种磷酸酶，在夜晚与Kai复合物结合时去磷酸化RpaA【2,3,5】。因此，作者们想用此体外时钟检测SasA或CikA在恒定条件下对于维持时钟输出的重要性，并确定SasA或CikA这些组分如何促进下游RpaA与DNA的结合。以前的生物钟研究范式认为，振荡器的计时完全依赖于Kai蛋白的，SasA或CikA仅负责输入输出信号。但是通过该体外时钟发现，Kai蛋白复合体中缺乏KaiB的情况下可以被SasA拯救，SasA通过异向协同性将KaiB招募到KaiC六聚体中。协同性是基于SasA和KaiB之间结构的相似，在体外消除异质协同性突变对昼夜节律的影响。另外，作者们也发现CikA也在KaiA水平较低的情况下可以挽救时间缺陷。 总的来说，作者们所建立的数据有助于揭示生物钟如何在体内进行转录-翻译的反馈环路以及如何进行蛋白质周转，另外生物钟中除了核心振荡器的组件Kai蛋白之外，输入和输出元件SasA或CikA也是生物钟中的关键组分。该工作所建立的体外时钟，可以对生物钟组分的生物化学特性与体内表型之间建立起因果关系，同时也为生物钟的研究提供了一个强大的体外平台。 参考文献 1 Ishiura, M. et al. Expression of a gene cluster kaiABC as a circadian feedback process in cyanobacteria. Science (New York, N.Y.) 281, 1519-1523, doi:10.1126/science.281.5382.1519 (1998). 2 Iwasaki, H. et al. A kaiC-interacting sensory histidine kinase, SasA, necessary to sustain robust circadian oscillation in cyanobacteria. Cell 101, 223-233, doi:10.1016/s0092-8674(00)80832-6 (2000). 3 Schmitz, O., Katayama, M., Williams, S. B., Kondo, T. & Golden, S. S. CikA, a bacteriophytochrome that resets the cyanobacterial circadian clock. Science (New York, N.Y.) 289, 765-768, doi:10.1126/science.289.5480.765 (2000). 4 Heisler, J., Chavan, A., Chang, Y. G. & LiWang, A. Real-Time In Vitro Fluorescence Anisotropy of the Cyanobacterial Circadian Clock. Methods and protocols 2, doi:10.3390/mps2020042 (2019). 5 Takai, N. et al. A KaiC-associating SasA-RpaA two-component regulatory system as a major circadian timing mediator in cyanobacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 103, 12109-12114, doi:10.1073/pnas.0602955103 (2006). |
|
|
