NGS实验室分区那些事儿

导 读

当前，高通量测序技术（NGS）在肿瘤基因突变检测领域发挥着越来越重要的作用，但新技术的广泛应用也给临床检测规范化带来了新的挑战。在规范化NGS实验室建立和使用的过程中，首先需要考虑“人员”、“设备”、“物料”、“方法”以及“环境”五个要素，以保证每一例样本检测结果的准确性。

本篇推文主要从“环境”这一要素，介绍NGS实验室的规范化布局以及基本仪器设备配置。

※ 文章素材来源于李金明《高通量测序技术》。

目前已建成的分子检测实验室普遍存在的问题包括：房间布局不合理，房间空间利用率低；实验室各区域内通风设施效果不佳，无法有效清除“污染物”；房间温湿度波动较大，影响仪器运行状态；实验室各区间压力按区域顺序梯度递减等。

由于NGS检测具有很高的灵敏度，在NGS检测过程中，样本源性污染、Index源性污染、扩增产物污染以及气溶胶污染均可能导致假阳性或者假阴性的结果。因此，为了保证检测结果的准确性，对高通量测序实验室进行合理有效的分区规划是至关重要的。

理想实验室

分区原则

实验室分区的基本原则是各区独立、注意风向、因地制宜、方便工作。

各区独立——实验室各分区间，不管是空闲时抑或是在使用中，其在物理上都应处于完全分隔状态，且各区域间不能有空气的直接流通。当需要将试剂物品转移至其他区时，可通过双开门传递窗传递。双开门传递窗以连锁装置设计为最佳，即两边门不能同时打开。

注意风向——在实验室各区间内，扩增产物可能会顺着空气气流进入上游扩增前的相对洁净区域。为防止这种污染的发生，在严格分区的同时，需注意空气流向。可通过在每个区域设置正负压缓冲间，隔绝实验室内外空气互通。

因地制宜——具体情况具体分析，并不要求实验室各区必须相互邻近，可分散在同楼层的不同处，甚至是不同楼层。

方便工作——日常检测工作是否方便，除了需要考虑各分区设计及空间和面积的合理性，大型仪器设备进出是否方便也是分区设计需要考虑的因素。

除此之外，因各个实验室检测项目、检测平台、检测流程以及工作量不同，还需以“工作有序、互不干扰、防止污染、报告及时”为基本准则，“个性化”设计NGS实验室分区数量和空间大小。

实验室布局

我们以肿瘤组织基因突变检测NGS实验室（illumina平台，杂交捕获方法）为例，介绍理想情况下的实验室布局：

 图1 肿瘤组织基因突变检测NGS实验室设计

                               （illumina平台，杂交捕获）                                 

1

试剂准备区

本区应为洁净区域，用于配制试剂、储存试剂及消耗品。若其他区污染通过空气流入该区域内，将影响后续操作流程和最终实验结果，所以需独立成区。此外，该区还需设置正负压缓冲间，避免实验室内外空气流通。后续各区域的缓冲间设置原则同该区一样。

2

标本制备区

本区为半污染区，用于样本DNA提取及其定量和浓度检测。起始DNA模板的质量和测序结果的准确性紧密相关，需严格遵循防污染要求，避免下游扩增产物对其污染。

若样本为福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本，还需设置标本制备前区，用于标本切片和HE染色。

3

打断区

本区为半污染区，用于样本DNA片段化。人类基因组DNA长度过长，而NGS检测的DNA片段范围在200~300bp左右，所以在文库制备前需要进行片段化处理，常用的有超声打断的物理方法。

若空间有限，可在标本制备区专门划分打断区域，但需注意打断后的样本不在该区域开盖转管，以免污染其他DNA模板，同时做到定期清洁打断区。

4

文库制备区

本区为半污染区，用于构建文库。DNA经片段化处理后产生粘性末端，需先修复补平为平末端，并在3'端加上“A”尾。之后，再在片段两端加上接头和标签。若接头或标签出现污染，导致样本间数据错分，检测结果的准确性也无法保证。

当标本量较少，且标签是通过DNA连接酶的非PCR反应加上的，则标本制备区和文库制备区可合并。

5

扩增一区

本区为半污染区，用于文库的预扩增和纯化。文库扩增涉及PCR过程，产生扩增产物的气溶胶，需独立成区。

6

杂交捕获区

本区为半污染区，用于捕获目的序列。

7

扩增二区

本区为半污染区，用于对捕获后的文库进行扩增，同时对终文库的浓度和片段大小进行检测以及测序文库的pooling工作。

8

测序区

本区为半污染区，用于文库上机测序。房间温度控制在18~22℃，2小时温度波动应小于2℃；湿度保持在20%~60%；避免人为引起的震动。

9

电泳区

本区为半污染区，用于检测提取后的DNA和超声打断后的DNA片段分析。

仪器设备

规划好各功能区后，还需配备相应的仪器设备，同时做上明确标记，避免不同区域间的设备发生混淆，造成交叉污染。

图2 各分区所需基本仪器设备 

注：A. 基本仪器配备；B. 样本制备室专用移液器

量体裁衣

然而，临床检测项目繁多，涉及不同的检测流程以及检测平台，那如何将这些项目进行整合，实现实验室的合理有效布局呢？

以同时开展病原体检测、肿瘤基因突变组织学样本和ctDNA样本检测项目的实验室为例。所使用的检测平台包括qPCR、一代测序（Sanger测序）和二代测序（illumina杂交捕获靶向测序）。

图3 多检测项目、多检测平台共存情况下的NGS实验室设计

相比于单检测项目、单检测平台而言，多检测项目、多检测平台共存情况下的NGS实验室布局要复杂一些，除了要遵循上述分区原则，还要合理规划现有空间，最大限度防止污染发生，保证日常检测工作的顺利进行。

区域独立

1

标本制备三区

为避免潜在生物安全风险，单独设置标本制备三区，用于病原体DNA的提取。

2

组织与血液提取、文库制备区

ctDNA浓度低且检测灵敏度高于组织样本，为避免样本间交叉污染，ctDNA样本和组织样本需分别设置标本制备区、文库制备区、扩增区和杂交捕获区来完成DNA提取和文库制备过程。

区域共用

在共用区域操作时，一定要注意防污染，如加样时，使用带滤芯的枪头而非普通吸头，减少由于吸样时气溶胶产生所致的交叉污染；或是样本经瞬时离心后再开盖；混匀样本用涡旋振荡方式或轻弹方式代替吹打方式等。

1

试剂准备区

本区为洁净区，不涉及样本核酸，可作为三种检测项目的共享区域。

2

扩增四区

因三种检测平台原理不同，故扩增四区除了用于组织样本文库扩增和富集，同时也可作为Sanger测序PCR反应和产物纯化以及病原体qPCR检测分析区。

3

测序区

由于二代测序文库带有特定的接头以及Index标签序列，可与一代测序上机样本区分开，二者不会产生交叉污染，因此二代测序上机和一代测序上机可放在同一区域内。

4

电泳区

电泳区用于电泳检测一代测序扩增产物和二代测序判断核酸质量、片段大小分析等步骤的公共区域。

结语

综上所述，NGS实验室规范化布局的根本目的是为了提供物理上的阻隔，防止各区域间的交叉污染。在实际工作中，设计实验室需要依据实际情况“量体裁衣”，以保障检测结果的准确性。

参考资料：

李金明. 高通量测序技术. 第一版. 北京：科学出版社，2018.

           本期介绍的“NGS实验室布局”就到这里啦，如想了解

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