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Epub 2020 Jan 9. 胶质母细胞瘤 (GBM) 是最具侵袭性和最致命的成人脑癌形式。广泛的基因组分析已经确定了 GBM 中不同信号通路的关键改变，包括 RTK/RAS/PI3K/PTEN、RB/CDKN2A 和 P53/ARF/MDM2 通路。针对调节这些的信号通路尝试，例如 EGFR 或 PI3K 抑制，对 GBM 患者预后的影响微乎其微 。虽然这些遗传改变会影响癌细胞生物学的许多内在方面，但人们越来越认识到，这些改变还促进旁分泌因子的表达，调节肿瘤微环境 (TME) 中免疫抑制细胞的募集和激活。例如，在 GBM 中，我们证明PTEN缺失/突变可以驱动赖氨酰氧化酶 (LOX) 的表达，从而促进免疫抑制性肿瘤相关巨噬细胞 (TAM) 的浸润，进而为胶质瘤细胞存活提供生长因子支持。这些研究强调了在胶质瘤细胞中识别基因改变的机会，这些改变建立了共生的癌症-宿主相互作用，包括 TME 中的免疫抑制机制。 除了上述遗传改变外，表观遗传程序的失调也会在许多层面上影响肿瘤生物学 。特别是，各种表观遗传调节剂已被证明在维持神经胶质瘤干细胞 (GSC)（如N 6 -mA、EZH2 和 DAXX）和调节肿瘤免疫（如组蛋白去乙酰化酶）中发挥关键作用。由于 GSC 对 GBM 中的肿瘤维持和治疗抗性都至关重要，因此这些调节因素具有额外的意义。此外，泛癌计算分析表明干性和免疫特征之间存在正相关。总之，这些见解促使我们对已知的表观遗传调节因子进行功能获得筛选，这些调节因子可能会双重增强 GSC 自我更新并促进免疫抑制性 TME。在此屏幕中，昼夜节律调节器 CLOCK成为热门话题。 昼夜节律是维持正常细胞和组织内稳态的重要调节系统 ，并且已被证明在与癌症相关的过程中发挥关键作用，例如细胞增殖和存活、DNA 修复、新陈代谢和炎症 。CLOCK 和 BMAL1（脑和肌肉 ARNT-Like 1；也称为芳烃受体核转运蛋白样蛋白 1，ARNTL）是构成异二聚体复合物的昼夜节律机制的两个关键转录因子。这种复合物可以激活PER和CRY的表达基因，最终形成一个负反馈回路来抑制 CLOCK:BMAL1 复合物的活性 。 人们越来越认识到 CLOCK 和 BMAL1 对癌症发病机制的影响高度依赖于环境和疾病 。例如，CLOCK 或 BMAL1 在前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌和胰腺癌中提供肿瘤抑制样功能，但在结肠直肠癌和急性髓性白血病中表现出肿瘤促进作用。在 GBM 中，CLOCK 或 BMAL1 是一种肿瘤促进因子，可通过调节 NF-κB 通路调节胶质瘤细胞增殖和迁移，并可通过调节合成代谢支持 GSC 功能。在这里，我们阐明了 CLOCK 通过上调 OLFML3（一种新型且有效的免疫抑制性小胶质细胞化学引诱剂）来支持免疫抑制性 TME 的新功能。人类 GBM 的临床病理相关性表明 CLOCK 和 OLFML3 是 GBM 的潜在治疗靶点。 CLOCK 促进 GSC 自我更新并在人类 GBM 中被放大: 使用先前表征的人类神经干细胞 (hNSC)，功能获得筛选显示 284 种表观遗传调节因子中的 31 种可以增强 hNSC 自我更新活动（图 1A）。CLOCK 表现出最高的自我更新活性，与阳性对照 myr-AKT 相当，并且通过免疫印迹分析证实了 CLOCK 过表达。癌症基因组图谱 (TCGA) GBM 数据集的检查显示，在大约 5% 的 GBM 病例中，CLOCK 而非其他表观遗传因素被放大。图 1B）和 2.8% 的低级别胶质瘤病例（图 1C）。此外，增加的基因拷贝数与增加的CLOCK mRNA 水平正相关（图 1D）。为了进一步证实 CLOCK 在促进 GSC 自我更新和维持方面的相关性，我们在具有相对高 CLOCK 表达的人类 GSC 中进行了 shRNA 介导的消耗研究，例如 GSC20、GSC167 和 GSC272。CLOCK 与 BMAL1 异二聚化，形成调节核心生物钟基因的转录因子复合物。在异二聚体中，一个伙伴的消耗会导致另一个组分的降解 。事实上，我们发现 shRNA 介导的 BMAL1 消耗降低了 CLOCK 的表达。图 1F) 和 GSC20 和 GSC272 的自我更新活动受损 (图 1G）。SR9009 是核受体 REV-ERBs 的激动剂，它作为 CLOCK:BMAL1 复合物的直接负调节剂发挥作用 。SR9009 处理抑制 GSC20 和 GSC272 的自我更新能力（图 1H)，加强了 CLOCK/BMAL1 在促进 GSC 自我更新中的作用。 
图1 CLOCK促进GBM中的小胶质细胞浸润：除了治疗抗性外，癌细胞的高干性已被证明与 21 种实体瘤（包括 GBM）中的免疫抑制途径呈正相关。事实上，在 CLOCK 耗尽的 GSC 中，GSEA 揭示了免疫抑制特征的显着表现，包括干扰素 γ/α 反应、TNFα/NF-κB 信号传导和炎症反应（图 2A）。这些免疫特征促使TCGA GBM 数据集使用经过验证的 18 种免疫细胞的基因集特征对 TCGA GBM 数据集进行计算机免疫细胞审计。对免疫细胞特征的分析表明，高 CLOCK 表达与增加的小胶质细胞和较小程度的造血干细胞 (HSC) 以及减少的 CD8 激活的 T 细胞和树突状细胞 (DC) 呈正相关；其他免疫细胞类型没有显着变化（图 2B）。相应地，使用 transwell 迁移测定，来自 CLOCK shRNA 敲低 GSC272、GSC20、U87 或 QPP7 细胞的条件培养基 (CM) 相对于来自 shRNA 对照细胞的 CM 表现出减少的小胶质细胞迁移（图 2C）。此外，CLOCK shRNA 敲低 QPP7 细胞中受损的小胶质细胞迁移可以通过重新表达 shRNA 抗性 CLOCK cDNA 来挽救）。同样，与来自 shControl 细胞的 CM 相比，来自 shBMAL1 GSC20 细胞的 CM 抑制小胶质细胞迁移（图 2D）。相反，来自 hNSC 和 GSC17 的具有强制 CLOCK 表达的 CM 相对于对照增加了小胶质细胞迁移（图 2E）。最后，在人类 GBM 组织微阵列 (TMA) 中，CLOCK 和 BMAL1 信号与小胶质细胞标志物 TMEM119 和 CX3CR1 的表达呈强正相关（图 2F，G）。总之，这些发现表明高 CLOCK 表达与免疫抑制性小胶质细胞浸润到 GBM TME 之间存在潜在联系。
图2 时钟调节的 OLFML3 促进小胶质细胞迁移：为了确定控制小胶质细胞募集的假定 CLOCK 调节的分泌因子，我们将微阵列分析数据与分泌蛋白数据相交。使用 ≥4.0 倍的表达变化，再加上 qRT-PCR 验证，11 个基因与 CLOCK 表达呈正相关，包括OLFML3、POSTN、TFPI2、LGMN、ALDH9A1、MCCC1、COL11A1、LYNX1、TFPI、LIPA和RBP4。OLFML3在 ishCLOCK GSC272 细胞中显示出最显着的减少（图 3A）。TCGA GBM 患者生物过程亚本体的基因本体富集分析 (GOEA) 显示OLFML3、LGMN和LIPA与白细胞迁移和趋化性相关，但与其他因素无关。此外，TCGA GBM 生物信息学分析表明，OLFML3、LGMN和LIPA的表达与小胶质细胞标志物（CX3CR1 和 TMEM119）呈正相关，其中OLFML3显示出最显着的相关性，促使进一步深入分析。使用免疫印迹的进一步研究表明，shRNA 介导的 CLOCK 或 BMAL1 消耗降低了几种 GSC 模型中 OLFML3 的表达，包括小鼠 QPP7（图 3C)，以及人类 GSC20 和 GSC272 (图 3D）。使用 transwell 迁移分析，重组 OLFML3 补充培养基以剂量依赖性方式显着增加小胶质细胞迁移，这与原型小胶质细胞趋化因子 CCL2（又名 MCP-1）的活性相（图 3E）。相反，来自 shRNA 介导的 GSC272 或 U87 细胞中 OLFML3 消耗的 CM 显示小胶质细胞迁移减少。图 3F）。为了评估 CLOCK 和 BMAL1 是否直接调节 OLFML3 表达，进行了 ChIP-PCR 测定，显示 CLOCK 和 BMAL1 与 OLFML3 启动子结合，并且这种结合在 CLOCK 耗尽的 GSC272 细胞中减少（图 3G）。此外，荧光素酶报告基因检测显示 CLOCK 诱导的转录活性被 OLFML3 启动子区域的 E-box 突变消除（图 3H）。我们得出结论，OLFML3 是一种新型的时钟调节趋化因子，具有强大的小胶质细胞募集活性。 图3
CLOCK 耗竭抑制 GSC 自我更新和肿瘤内小胶质细胞浸润并延长生存期：为了进一步研究 CLOCK 在 GBM 肿瘤生物学中的作用，我们利用 ishCLOCK 系统诱导性消耗植入 SCID 小鼠的 GSC272 和 GSC20 肿瘤中的 CLOCK，揭示 CLOCK 消耗显着延长了存活时间（图 4A，B）。使用从致癌物诱导的神经胶质瘤中分离并具有 GSC 样表型 的鼠模型 CT2A，CLOCK 或 BMAL1 的消耗导致 C57BL/6 小鼠的存活率显着延长 (图 4C,,D)。D）。类似地，CLOCK:BMAL1 复合物的药理学抑制延长了植入 CT2A 细胞的 C57BL/6 小鼠的存活时间（图 4E）。在组织学水平上，GSC 干细胞标志物 OLIG2 和巢蛋白，以及增殖标志物 Ki67 显着减少，而 CLOCK 耗尽后细胞凋亡增加（图 4F,，G;G）。此外，在 CLOCK 耗尽的肿瘤中，浸润的小胶质细胞显着减少（10 倍）（图4H）。由于 OLFML3 在小胶质细胞迁移中起重要作用，我们还探讨了 shRNA 介导的 OLFML3 消耗对 GBM 生长的影响，并发现 GSC272 模型中 OLFML3 的降低显着延长了存活时间（图 4I）。总之，这些体内结果证实了 CLOCK 在促进 GBM 肿瘤维持中的作用，这与 CLOCK 诱导的干性、增殖和存活增强以及小胶质细胞向 GBM TME 的募集增加相关。
图4 在这项研究中，我们通过其对 GSC 自我更新和免疫的调节，揭示了核心昼夜节律调节因子 CLOCK 和 BMAL1 在 GBM 肿瘤维持中的作用和潜在机制。我们将 OLFML3 鉴定为 GBM 中一种新型且有效的 CLOCK 调节的小胶质细胞趋化剂，并证明 OLFML3 消耗可以提高存活率。CLOCK:BMAL1 复合物在 GBM 肿瘤生物学中的关键作用，特别是其对特定代谢和免疫基因（如 OLFML3）的调节，阐明了控制干性和免疫抑制等关键癌症标志的潜在治疗靶点。Reference:Circadian Regulator CLOCK Recruits Immune-Suppressive Microglia into the GBM Tumor Microenvironment doi: 10.1158/2159-8290.CD-19-0400
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