新型光驱动离子通道的结构阐明和高性能分子工具的创造~聚焦神经科学~

2022年0月03日 新型光驱动离子通道的结构阐明和高性能分子工具的创造~聚焦神经科学~ 1. 1 .主讲人: 岸孝一郎(东京大学研究生院综合文化研究科广域科学专业硕士2年级) Yoon Seok Kim(Postdoctoral fellow，department of bio工程，Stanford University ) 福田昌弘(东京大学研究生院综合文化研究科附属先进科学研究机构特任助教) 井上昌俊( Postdoctoral fellow，Department of Bioengineering，Stanford University ) 草木迫司(东京大学研究生院理学系研究科生物科学专业助教) Peter Wang(Postdoctoral fellow，department of bio工程，Stanford University ) 野村纪通(京都大学研究生院医学研究科副教授) 岩田想(京都大学研究生院医学研究科教授) 井上圭一(东京大学物性研究所副教授) Karl Deisseroth(Professor，department of bio工程，Stanford University ) 加藤英明(东京大学研究生院综合文化研究科广域科学专业附属先进科学研究机构副教授)

２． 2 .发布要点: 对于通过光刺激输送阳离子的蛋白质、通道视紫红质(注1、2 )中近年来特别关注的ChRmine (注3 )，使用低温电子显微镜(注4 )确定其立体结构，明确了ChRmine作为离子通道发挥作用的机制。 利用得到的立体结构知识，制作自然界中不存在的修饰型ChRmine，作为分子工具使用，使更发展的光遗传学实验(注5 )成为可能。 本研究有望加深对通道视紫红质离子转运机制多样性的理解，进而使所开发的修饰型ChRmine通过光遗传学为神经科学和医疗的发展做出贡献。

3. 3 .发布概述: 光遗传学是通过“光”控制特定神经细胞活动的创新技术，现在已经成为神经科学中必须的技术。 光遗传学利用光接受蛋白通道视紫红质作为工具，每天都有新的光遗传学工具被发现和改进。 近年来自然界中发现的通道视紫红质ChRmine不仅作为一种光遗传学工具具有非常强的性能，即高离子电流、高光敏性、长波长光激活，而且其功能为通道视紫红质，但氨基酸序列为泵型 但尚不清楚ChRmine为什么能充当离子通道。 这次，东京大学研究生院综合文化研究科的岸孝一郎、加藤英明副教授等小组利用低温电子显微镜成功地决定了ChRmine的立体结构。 结果表明，ChRmine在全局上与泵型非常相似，但在局部上具有多个传统泵型、通道型中看不到的结构特征，这有助于决定ChRmine的独特分子功能。 而且，从得到的立体结构的见解出发，开发了进一步提高了被长波长光活化的ChRmine性质的修饰型ChRmine，使利用3色可见光同时对多个神经细胞群体进行光操作测量的更为发展的光遗传学实验成为可能。 本研究成果不仅加深了对多种通道视紫红质作为离子通道的机制的理解，而且为新视紫红质的设计和创制提供了路标，以及为神经科学领域提供了有力的工具，有望促进神经科学、医疗的发展。 本研究成果将于2022年2月2日(美国东部标准时间)刊登在美国科学杂志《Cell》的在线版上。

4. 4 .发布内容: 研究背景 许多生物，从人到微生物，通过光接受蛋白接收光，从那里接收信息和能量。 在光接受蛋白质中，微生物拥有的作为离子泵和离子通道发挥作用的“离子输送型视紫红质”，是将光能转换为离子输送这一工作的精巧的分子装置。 该性质受到关注，离子转运型视紫红质被用作可以通过光控制特定神经细胞活动的实验工具，在神经科学中成为了必须的技术(光遗传学)。 但是，迄今为止作为光遗传学工具使用的通道视紫红质存在光电流弱、光敏感性低、只能用短波长光(蓝色)的光激活的问题。 作为光遗传学工具，近年来自然界中发现的通道视紫红质ChRmine具有非常强的性能，它可以被高离子电流、高光敏性和长波长光(红光)激活。 另外，基于氨基酸序列的系统分析表明，尽管功能是通道视紫红质，但氨基酸序列具有与泵型视紫红质相近的有趣特征(图1 )。 但是“ChRmine和泵型视紫红质有多相似”、“如果相似，为什么ChRmine可以作为离子通道工作”、另外，还存在“能否制作出进一步提高ChRmine性质的光遗传学工具”的疑问。研究内容 这次，以东京大学研究生院综合文化研究科的加藤英明副教授为中心的研究小组利用低温电子显微镜，成功地以2.0分辨率(注7 )这一非常高的分辨率决定了ChRmine的立体结构。 结果表明，ChRmine形成三聚体，与通过形成双聚体发挥作用的传统通道视紫红质相比，与形成三聚体的泵型更相似(图2 )。 另外，通过单体之间的结构比较发现，与传统的双聚通道视紫红质相比，ChRmine更像泵型视紫红质(图3A )。 接下来，为了回答“为什么ChRmine能够在具有与泵型类似的结构的同时作为离子通道发挥作用”的问题，仔细观察了单体的结构。 于是，ChRmine与泵型视紫红质相比: (1)第2个跨膜螺旋在细胞内外向外侧倾倒；(2)第3个跨膜螺旋在膜中途松开；(3)第1个细胞外环路较长且曲折 结果表明，ChRmine在细胞内外具有离子透过的大孔隙(图4 )。 一个个输送离子的泵型在单体体内没有空隙，另一方面，迄今为止结构已经明确的通道视紫红质，全部在单体体内具有作为离子透过通道发挥作用的空隙，这表明具有空隙对于ChRmine作为通道发挥作用是重要的。

 接着，以利用从结构中得到的知识“制造进一步提高了ChRmine性质的光遗传学工具”为目标，着眼于被ChRmine的长波长光(红光)激活的特征。 而且，本研究组通过改变吸收光部位周边的氨基酸残基，生成包括能够被更长波长侧(红色侧)的光活化的rsChRmine(red-shifted的意思)在内的3种ChRmine改变体( rsChRmine，，) 另外，通过使用该rsChRmine，世界上首次成功了利用3种颜色(蓝、黄、绿)的光，在活的老鼠大脑内同时对多个神经细胞群体进行光操作测量的“3色光遗传学实验”(图5A )。 最后，研究表明rsChRmine是第一个在近红外光(> 740 nm )下也能激活的通道视紫红质，证明了rsChRmine的杰出性能(图5B )。 今后的开展 本研究首次明确了“与泵型相近的新品种通道视紫红质”ChRmine的立体结构。 此次结果不仅促进了对多种通道视紫红质离子渗透机制的了解，而且拓宽了通道视紫红质结构分析方法的广度，为阐明视紫红质分子进化提供了新的线索。 此外，本研究利用所获得的结构信息，创造出进一步发挥ChRmine所具有杰出性能的3种修饰体( rsChRmine、hsChRmine、frChRmine )，特别是利用rsChRmine使新的光遗传学实验成为可能 这些ChRmine修饰体不仅有望推动神经科学的研究，也有望用于眼精疾病的基因治疗应用等。 本研究主要涉及“JST创造性研究支援事业(课题编号: JPMJFR204S )”、“JST CREST (课题编号: JPMJCR21P3)”、“JST先驱(课题编号: JPMJPR1782、JPMJPR1888 )”、“ JP20K21383、JP21H01875 )”的支持下实施的。

5. 5 .发表杂志: 杂志名称: Cell (在线版: 2022年2月2日) 论文标题: structural basis for channel conduction in the pump-like channelrhodopsin chr mine 作者: Koichiro E. Kishi，Yoon Seok Kim，Masahiro Fukuda，Masatoshi Inoue，Tsukasa Kusakizako，Peter Y. Wang，Charu Ramakrishnan Elina Thadhani，Joseph M. Paggi，Toshiki E. Matsui，Keitaro Yamashita，Takashi Nagata，Masae Konno，Sean Quirin，Maisie Lo，，。 Tomoko Uemura，Kehong Liu，Mikihiro Shibata，Norimichi Nomura，So Iwata，Osamu Nureki，Ron O. Dror，Keiichi Inoue，Karl deisseser DOI编号: 10.1016/j.cell.2022.01.007 6. 6 .咨询方式: <有关研究的事情> 东京大学研究生院综合文化研究科广域科学专业附属先进科学研究机构 副教授加藤英明 Tel: [phone] e-mail:he kato [ at ] bio.c.u-Tokyo.AC.jp 东京大学物性研究所 副教授井上圭一 Tel: [phone] 电子邮件: inoue [ at ] issp.u-Tokyo.AC.jp 京都大学研究生院医学研究科分子细胞信息学 教授岩田想 Tel: [phone] e-mail:s.I wata [ at ] m four.med.Kyoto-u.AC.jp <关于JST事业的事> 科技振兴机构战略研究推进部创意研究支援事业推进室 浅野佳那 Tel: [phone] 电子邮件: souhatsu-inquiry [ at ] jst.go.jp <有关报道的事情> 东京大学教养学部等总务科宣传信息企划小组 Tel: [phone] e-mail:koho-j yoho.c [ at ] GS.mail.u-Tokyo.AC.jp 东京大学研究生院理学系研究科理学部宣传室 Tel: [phone] e-mail:kou Hou.s [ at ] GS.mail.u-Tokyo.AC.jp 东京大学物性研究所宣传室 Tel: [phone] 电子邮件: press [ at ] issp.u-Tokyo.AC.jp 京都大学总务部宣传科国际宣传室 Tel: [phone] e-mail:comms [ at ] mail2.ADM.Kyoto-u.AC.jp 科学技术振兴机构宣传科 Tel: [phone] 电子邮件: jst koho [ at ] jst.go.jp

5. 5 .发表杂志: 杂志名称: Cell (在线版: 2022年2月2日) 论文标题: structural basis for channel conduction in the pump-like channelrhodopsin chr mine 作者: Koichiro E. Kishi，Yoon Seok Kim，Masahiro Fukuda，Masatoshi Inoue，Tsukasa Kusakizako，Peter Y. Wang，Charu Ramakrishnan Elina Thadhani，Joseph M. Paggi，Toshiki E. Matsui，Keitaro Yamashita，Takashi Nagata，Masae Konno，Sean Quirin，Maisie Lo，，。 Tomoko Uemura，Kehong Liu，Mikihiro Shibata，Norimichi Nomura，So Iwata，Osamu Nureki，Ron O. Dror，Keiichi Inoue，Karl deisseser DOI编号: 10.1016/j.cell.2022.01.007 6. 6 .咨询方式: <有关研究的事情> 东京大学研究生院综合文化研究科广域科学专业附属先进科学研究机构 副教授加藤英明 Tel: [phone] e-mail:he kato [ at ] bio.c.u-Tokyo.AC.jp 东京大学物性研究所 副教授井上圭一 Tel: [phone] 电子邮件: inoue [ at ] issp.u-Tokyo.AC.jp 京都大学研究生院医学研究科分子细胞信息学 教授岩田想 Tel: [phone] e-mail:s.I wata [ at ] m four.med.Kyoto-u.AC.jp <关于JST事业的事> 科技振兴机构战略研究推进部创意研究支援事业推进室 浅野佳那 Tel: [phone] 电子邮件: souhatsu-inquiry [ at ] jst.go.jp <有关报道的事情> 东京大学教养学部等总务科宣传信息企划小组 Tel: [phone] e-mail:koho-j yoho.c [ at ] GS.mail.u-Tokyo.AC.jp 东京大学研究生院理学系研究科理学部宣传室 Tel: [phone] e-mail:kou Hou.s [ at ] GS.mail.u-Tokyo.AC.jp 东京大学物性研究所宣传室 Tel: [phone] 电子邮件: press [ at ] issp.u-Tokyo.AC.jp 京都大学总务部宣传科国际宣传室 Tel: [phone] e-mail:comms [ at ] mail2.ADM.Kyoto-u.AC.jp 科学技术振兴机构宣传科 Tel: [phone] 电子邮件: jst koho [ at ] jst.go.jp

7. 7 .术语解释: (注1 )视紫红质 从人到微生物很多生物都拥有的光接受蛋白质。 是7次跨膜蛋白质，中心结合了视黄醛作为吸收光的低分子。 (注2 )通道视紫红质 视紫红质中也作为按照离子电化学梯度输送离子的“离子通道”发挥作用的物质。 2002年从藻类中发现的。 (注3 ) ChRmine (卡迈因) 2019年在自然界发现的新通道视紫红质。 作为光遗传学工具，具有优异的性能，可以进行“以单一细胞水平同时光操作测量100多个神经细胞的全光型电生理学”、“不进行手术，通过颅骨激活大脑深部区域的无纤维光遗传学”等多种发展性光遗传学实验，此外，由于有报道称其有可能应用于视网膜色素变性症的治疗，目前备受关注。

 (注4 )低温电子显微镜 2017年获得诺贝尔化学奖的技术。 与一般的光学显微镜不同，这是在极低温环境(低温)下对蛋白质样品照射电子射线，根据其投影图像计算求出立体结构的方法。 通过这种方法，蛋白质结构分析所需的时间大幅缩短，备受关注。 (注5 )光遗传学(光遗传学) 这是opto (光)和genetics (遗传学)的组合，正如其含义所示，是利用遗传学的方法在特定的神经细胞中表达光接受蛋白，通过光调控神经细胞活动的技术。 由Stanford大学的Karl Deisseroth博士等人提出。 (注6 )泵型视紫红质 与通道视紫红质(注2 )相反，向细胞内外单向输送离子的视紫红质。 (注7 )分辨率 分辨率指标。 用于显示电子显微镜结构分析的质量时，值越小则分辨率越高。 2.0分辨率是通道视紫红质结构分析的最高分辨率之一。 (注8 ) hsChRmine 加快ChRmine运动学(从关闭光到通道关闭的速度)的改变体。 (注9 ) frChRmine 导入rsChRmine的变异与导入hsChRmine的变异相乘的改变体。注10 ) r.m.s.d值 蛋白质结构相似度的指标。 值越小，相似度越高。

图1 .基于用作光遗传学工具的“离子转运视紫红质”系统分析的分组。 ChRmine属于一组与泵型相近的新种通道视紫红质。

图2. ChRmine和泵型视紫红质、通道视紫红质的总体结构。 传统的通道视紫红质形成2聚体，而ChRmine、泵型视紫红质形成3聚体。 

图3. (A ) ChRmine与泵型视紫红质、通道视紫红质分别重合。 根据表示结构相似度的r.m.s.d值(注10 )，ChRmine比通道型更接近泵型。 ( b ) ChRmine单体的结构。 其特征是短跨膜螺旋3号和曲折的细胞外环1号。

图4. ChRmine和泵型视紫红质、通道视紫红质各自的离子通道。 泵型视紫红质在单体体内没有空隙，而ChRmine及通道视紫红质具有作为离子通道的空隙。

图5. (A )使用三色光的发展性光遗传学实验示意图(左)和实际数据(右)。 这个实验中使用了三种蛋白质。 第一个是用于激活PV神经元的rsChRmine。 第二个是用于测量Pyr神经元活动的荧光蛋白a。 第三个是荧光蛋白b，用于测量作用于Pyr神经元的PV神经元的活动。 PV神经元激活后，其刺激传递到Pyr神经元，抑制Pyr神经元。 ( b ) rsChRmine在720 nm和750 nm等近红外光下也被激活，大大刷新了通道视紫红质激活波长的记录。