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大家好，感谢大家多年以来的陪伴。在此，小编祝大家新年快乐，虎年大吉。 Outline： 1. 蛋白偶联与标记方法（化学偶联、酶法偶联）
2. 蛋白邻近标记方法 3. 应用 4. 拓展 1. 蛋白偶联与标记方法
赖氨酸Lys侧链带有氨基，由于其亲核性、高溶剂暴露性和蛋白中较高的丰度，是天然蛋白修饰中研究最多的氨基酸之一，多种FDA批准的ADC药物都是利用Lys残基作为生物偶联位点来连接warheads。经典伯胺生物偶联通常是利用亲电试剂，例如针对Lys的NHS酯，但是它们在中性缓冲液中易于水解以及与其他亲核氨基酸残基的潜在副反应，限制了其应用。因此，开发高效、高化学选择性的Lys生物偶联方法具有重大意义。
阿扎菲酮是一种独特的真菌多酮代谢物，其特征是具有多个氧的吡喃醌双环核心。阿扎菲酮能在温和的生理条件下与伯胺发生反应，生成相应的乙烯-γ-吡啶酮（vinylogous γ-pyridones, vPDNs）motif，是一些天然产物的来源（例如( )- isochromophilone VI和rubropunctatin）。这个反应在溶液条件下的副产物只有水，非常适用于生理环境。利用这一反应，可以实现对赖氨酸的快速偶联。阿扎菲酮只要30 min就能快速完成对Lys的标记，且几乎不和其它氨基酸反应。与传统的NHS活化酯相比，阿扎菲酮具有良好的化学稳定性【Angew. Chem. Int. Ed. | 阿扎菲酮用作伯胺特异性生物偶联试剂】。 
对生物分子进行位点选择性的化学修饰在生命科学和药物开发中非常重要，其中半胱氨酸Cys作为修饰位点具有亲和性强、总体丰度低（因此容易实现单位点功能化）等优点，目前Cys标记中应用最广泛的是Michael加成受体马来酰亚胺。但该结构在存在其他硫醇分子或者还原环境中较不稳定。除了单位点的Cys化学修饰，双反应位点的Cys试剂也应用广泛，其主要应用于抗体的功能化，用于提升抗体的热稳定性。配体导向性偶联试剂能够进一步增强偶联的位点选择性。正如【J. Am. Chem. Soc. | 用CoLDR化学实现对内源性蛋白的位点特异性标记】中所提到，作者基于酪氨酸激酶BTK的一种抑制剂设计了Ibrutinib探针以靶向BTK活性位点，并进而共价连接活性位点周围的活性半胱氨酸，从而实现了炔基或其它荧光基团的引入，并跟踪了BTK蛋白在体内自然降解的过程，同时筛选了一批可以耐受体内固有谷胱甘肽的探针分子。作者进一步使用这种共价配体定向释放（covalent ligand directed release, CoLDR）位点特异性标记策略，通过非遗传学手段实现了对K-RasG12C系列和SARS-CoV-2 PLpro的特异性标记，理论上能够拓展到其它活性口袋附近存在活性半胱氨酸的蛋白上。
研究者们已经对半胱氨酸、赖氨酸、谷氨酸、天冬氨酸和甲硫氨酸等氨基酸进行了一定程度的功能解析，而对酪氨酸残基的全局性解析才刚刚起步。酪氨酸在蛋白质中丰度较低，且由于苯酚具有两亲性，所以也会有一部分酪氨酸暴露在蛋白表面。这些酪氨酸参与到蛋白质磷酸化修饰，酶底物之间的结合以及蛋白-蛋白相互作用中，所以对酪氨酸残基的动态调控对于研究蛋白活性，调节蛋白功能具有重要的意义。
苯恶嗪衍生分子作为多功能的偶联试剂与酪氨酸侧链反应，既可以进行内源性蛋白质标记，也可以在此后应用于生物正交合成。研究者设计了10氢-吩恶嗪-3,7-二甲醛，含有的芳香醛结构，在生物相容性条件下，可以与多种分子发生低效缩合。并且，该结构会延伸苯恶嗪π-共轭作用，可以使任何修饰的蛋白质加合物产生荧光。通过这种苯恶嗪双醛设计，实现了活性蛋白酪氨酸选择行化学官能团偶联方法的开发。可以在水溶液中温和条件下将苯恶嗪二醛选择性地偶联到多种天然蛋白质的特定酪氨酸残基上。该方法极高的化学选择特性，从一个复杂蛋白质上的26个酪氨酸残基中选择标记一个酪氨酸的能力，具有非常广泛的应用前景【Nat. Chem. |光催化的酪氨酸位点选择性生物结合用于天然蛋白质转化】。S-氰化肽的肼解为天然化学连接（NCL）提供了关键基团——酰肼，该方式无需任何内含肽或Sortase A酶的帮助。然而目前使用的非选择性S-氰基化方法对于蛋白质中多个半胱氨酸具有一定的局限性。【Angew. Chem. Int. Ed. | C端四半胱氨酸标签实现的蛋白质连接与标记】一文中提到一种区域选择性氰基化和无痕肼解策略：在感兴趣蛋白的C 末端融合四半胱氨酸标签——CCPGCC，该标签可以被双砷化合物（FlASH-EDT2）高度选择性地靶向并被其保护，进一步将 2-溴苯乙酮 (PacBr) 添加到反应混合物中以对剩余的 Cys 进行正交保护，该部分将一直保留到肼解或 NCL 之后。然后加入过量的二硫醇试剂 EDT以在几分钟内将FlASH-EDT2 从四半胱氨酸标签脱除。接下来，作者即可通过简便的 NTCB对四半胱氨酸标签上的巯基进行特异性的氰基化反应以及后续顺利的肼解，转化成肽酰肼。在肽酰肼活化为相应的硫酯后，即可与另一种模型肽进行 NCL，得到 Pac 标记的连接产物。生物正交偶联反应，在实现生命体内生物分子的成像、功能调节等方面具有十分重要的作用。2020年，研究人员基于环张力炔烃BCN，将四唑-烯烃光点击化学反应拓展至四唑-炔烃。然而，该工作发展了反应体系较为疏水，不利于在生命体中进行应用。【J. Am. Chem. Soc. | 光诱导的超快生物正交蛋白标记】报道了一种水溶性的四唑-炔烃光点击化学反应，该体系由具有水溶性与空间屏蔽效应的四唑分子，与具有环张力的BCN分子共同组成，具有极高反应速率。
转肽酶通过特异性识别遗传编码的识别结构域，可催化蛋白、多肽之间的偶联反应，在蛋白修饰与合成中具有重要应用。Sortase介导的连接反应（SML）是选择性偶联和修饰多肽以及蛋白质的一种常用工具。连接反应通过sortase识别保守的LPxTG基序（x可为任意氨基酸），在苏氨酸处结合形成硫酯中间体，释放下游序列，中间体可以进一步和N端带有甘氨酸的蛋白或多肽反应实现偶联。然而，多组分SML是十分困难的。但是，如果将底物的N端利用对光敏感的邻硝基二甲氧基苯甲氧羰基(Nvoc)保护，变为关闭状态，从而使底物C端暴露的基序可以与另一分子的N端实现连接，后续进一步脱除底物N端保护基，能够使N端从关闭状态转变为活性状态，实现与第三种分子的连接。通过调控底物从关闭状态到活性状态的转变，从而可以重复SML的过程，实现多片段连接【Angew. Chem. Int. Ed. | Sortase介导的多片段组装】。
近期，天冬酰胺内肽酶（AEPs），由于其更短的三肽识别结构域和更高的酶促反应效率，被视为下一代转肽酶。然而，所有已知的转肽酶都只能实现N端-C端的酶促偶联反应，限制了蛋白质偶联产物的潜在种类。通过开发工程化的天冬酰胺连接酶，能够对底物选择性进行设计，从而拓展偶联反应范围。目前已开发出工程化的天冬酰胺连接酶[C247A]OaAEP1，另外通过构建一个具有N端GLH序列以及C端Leu-Eda序列的多肽分子作为双功能连接基团，通过工程化酶实现两蛋白质之间的C端-C端偶联【Angew. Chem. Int. Ed. | 工程化转肽酶实现蛋白C端-C端偶联】。2. 蛋白邻近标记方法
邻近标记策略是近些年来发展十分迅速的蛋白标记方法，被广泛应用于蛋白-蛋白相互作用以及区域定位等方面。蛋白质-蛋白质相互作用及质膜上的蛋白质周围环境与细胞的生物功能、细胞过程密切相关，在不干扰细胞微环境的情况下检测瞬时结合相互作用是一个重大挑战。尽管目前有BioID，TurboID和APEX等邻近标记手段，但是由于这些标记过程中引入了不同的细胞毒性物质，对细胞的氧化还原通路等过程产生影响。因此，研究者们不断尝试开发不会引起显著细胞毒性的邻近标记方法。NNMT催化S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)依赖性甲基化，将烟酰胺(NAM)转化成N-甲基烟酰胺(Me-NAM)，4-氯吡啶同样可以作为NNMT底物来生成相应的甲基化产物。受到该酶促反应的启发，研究者设计了炔基取代的4-氯吡啶，作为自杀性探针，可以被NNMT催化甲基化，这种N-甲基化产物具有亲电性，可以扩散出活性位点并共价修饰近端蛋白质上的半胱氨酸。将标记的蛋白质通过铜催化的叠氮化物-炔环加成(CuAAC)化学连接到生物素-叠氮化物，通过链霉亲和素富集，就可以对邻近的蛋白通过串联质谱法鉴定【J. Am. Chem. Soc. | 特异性标记半胱氨酸的邻近标记方法】。为了阐明蛋白质周围环境以及理解疾病的病理机制和发现疾病生物标志物，一种能够在内源环境中用于邻近标记的核酸工具Apt-Gq/h被开发出来。Gq/h即G四链体/血红素，是一种基于核酸的辣根过氧化物酶模拟物，已广泛应用于比色检测、电化学传感、蛋白修饰、和有机底物的氧化转化。在这里，适配体作为一个锚结合感兴趣的蛋白质(POI)。G-四链体/血红素复合物通过催化惰性小分子底物转化为短寿命活性物质来诱导对于POI的邻近标记。标记的蛋白质随后可以进行亲和力富集和蛋白质组学分析【Anal. Chem. | 用于选择性和非遗传性邻近标记膜蛋白的核酸工具】。
3. 应用
近期，研究人员发现DNA表观遗传学修饰可能引发DNA-蛋白交联（DPCs）的形成。DNA胞嘧啶中5位的甲酰基化（5fC）是DNA表观遗传学标记5mC在生物体内氧化的代谢产物，可认为是一种特殊的DNA表观遗传学标记。由于芳甲酰基活泼的反应活性，5fC可以与组蛋白中Lysine或Arginine中的氨基形成可逆的席夫碱偶联产物。【Angew. Chem. Int. Ed. | 位点特异性DNA-蛋白质交联的合成及对DNA复制的影响】一文中，作者使用oxime ligation反应，于体外合成了5fC与H3K4位点特异性的DNA-蛋白质交联产物，并证实上述DPC对于DNA复制的阻碍，以及生命体对于上述DNA损伤潜在的克服方法。蛋白中的组氨酸残基存在两种互变异构体，分别为氢原子位于ε位的氮原子上的Nε–H和氢原子位于δ位氮原子的Nδ–H，通常情况下组氨酸更倾向于形成Nε–H的形式，但在某些活性口袋内部例如丝氨酸水解酶中，组氨酸的主要形式为Nδ–H。常用的蛋白标记试剂DEPC很容易与组氨酸残基反应，并能与两种互变异构体形成不同的产物，从而对其进行区分【Anal. Chem. | 通过蛋白共价标记区分组氨酸互变异构体】。进一步的“功能性邻近标记(functionalproximity labeling)”策略，即通过结合邻近标记技术和特定蛋白类型富集策略，实现对特定细胞区域内特定蛋白种类的大规模蛋白质组学分析，成功实现了对特定细胞区域内的磷酸化蛋白，O-GlcNAc修饰蛋白，以及RNA结合蛋白的富集与检测【Nat. Commun. | 功能性邻近标记实现RNA结合蛋白的时空分析】。鲍曼不动杆菌（Acinetobacterbaumannii）是一种感染性革兰氏阴性菌，由于其对大多数一线抗生素逐渐产生了耐药性，而被世卫组织认为是需要立即关注的重点病原体，针对其的新型抗菌剂开发更是迫在眉睫。Pse在结构上与哺乳动物中的唾液酸结构相似，而被称为伪神经氨酸，但由于其提取困难且具有抗原异质性，而并未被成功应用于疫苗策略中。通过邻苯二醛和伯胺的特异性反应将Pse小分子和载体蛋白CRM197或BSA连接在一起，得到疫苗分子Pse-CRM197和底物探针Pse-BSA，成功激起和维持有效的针对鲍曼不动杆菌的免疫反应，具有重要的临床意义【ACS Cent. Sci. | 伪神经氨酸-蛋白偶联疫苗实现对鲍曼不动杆菌的抵抗】。
4. 拓展
生物偶联工具设计的传统标准之一是与水具有兼容性，因此人们发展了各种巧妙的方法克服有机化学反应在水中发生的困难。目前开发出一项替代型的生物偶联策略，即使用与生物分子兼容的非水性介质作为生物偶联的反应介质，被称为非水驱动反应溶剂中的生物偶联(termed Bioconjugation In Nonaqueous-Driven Reaction Solvent，BINDRS)。研究人员在离子液体中成功实现了膦介导的氨基-叠氮生物偶联【J.Am. Chem. Soc. | 变“不可能”为“可能”——离子液体作为反应介质推动生物偶联方法的开拓】。这种使用非传统介质的生物偶联策略，大大扩展了生物偶联化学方法的范围，期待更多原不可企及的生物偶联的方式被发现。 
以上，为王初课题组分享的文献中有关蛋白偶联与标记的内容，欢迎大家交流与学习。
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