大家好,这里是专注表观组学十余年,领跑多组学科研服务的易基因。 近年来,RNA m6A甲基化作为国家自然科学基金表观遗传学研究的热门领域,相关研究产出呈爆炸式增长,高分文章不断。本期,易基因通过对什么是RNA甲基化、m6A甲基化是否可逆、m6A甲基化的识别、m6A甲基化修饰的功能、m6A甲基化的主要研究方向、m6A甲基化检测技术工具的选择、m6A甲基化数据挖掘思路、m6A甲基化下游实验设计等八大核心问题进行总结,让您一问读懂m6A甲基化。 1、什么是RNA甲基化 RNA上修饰的种类很多,包括甲基化、羟甲基化、乙酰化等。m6A是RNA上最丰富的一种修饰,平均每条转录本有1~3个m6A修饰。m6A存在于大多数真核生物(包括哺乳动物、昆虫、植物和酵母)和一些病毒的mRNA中,也存在于tRNA、rRNA、小核RNA(small nuclear RNA, snRNA)以及一些长链非编码RNA。m6A甲基化(N6-methyladenosine)是指RNA分子在RNA甲基化转移酶复合体(MTC)的作用下将甲基选择性地添加到特定腺嘌呤碱基上的过程。 2、m6A甲基化是否可逆? m6A甲基化是动态可逆的。
3、m6A甲基化的识别
4、m6A甲基化修饰的功能 m6A识别蛋白介导了m6A修饰对RNA的各种功能,m6A甲基化通过基因转录后调控,参与细胞分化、胚胎发育、X染色体失活、环境应激和各种疾病的发生发展。
5、m6A甲基化的主要研究方向 m6A甲基化目前主要运用在分子机制的理论性研究。 6、m6A甲基化检测技术工具的选择 MeRIP-seq和微量MeRIP-seq用于转录组范围内研究探索,并筛选目标基因。MeRIP-seq技术具有建库简单,技术成熟等优势,微量MeRIP-seq具有建库简单,技术成熟,低起始量等优势。易基因自主研发微量RNA甲基化检测技术,样本起始量可降低至10-20μg,最低仅需5μg总RNA。 MeRIP-qPCR需要结合Input的qPCR结果进行分析,应用方向为后续目标基因的甲基化验证,具有靶基因、准确性更高等优势。 7、m6A甲基化数据挖掘思路 m6A甲基化数据挖掘主要有三步:
8、m6A甲基化下游实验设计 (1)简单验证 A. 目标基因m6A甲基化的验证:MeRIP-RT-PCR B. 检测目标基因的mRNA表达水平:RT-qPCR C. 检测目标基因蛋白质表达水平:Western blot (2)全局m6A甲基化干扰实验(非靶向),验证m6A甲基化书否真的影响目标基因表达和细胞功能 A. m6A甲基化干扰:m6A writers/erasers的突变/敲降/敲除/过表达、m6A甲基化抑制剂 B. 检测m6A甲基化整体变化:m6A甲基化免疫荧光染色(定性)、m6A斑点杂交(定性)、比色法(定量)、质谱法(定量) C. 检测目标基因的m6A甲基化变化:MeRIP-qPCR D. 检测目标基因的mRNA水平:RT-qPCR E. 检测目标基因蛋白质水平:Western blot F. 检测细胞功能/表型变化 (3)靶向目标基因的甲基化/去甲基化实验,检测某区域m6A修饰是否真的影响目标基因的表达 A. 目的基因m6A甲基化干扰细胞系的构建:荧光素酶活性分析实验(Luciferase activity assay)——构建含甲基化/未甲基化m6A位点的目标基因-荧光素酶表达质粒,转染细胞并表达。 B. 检测目标基因的m6A甲基化变化:MeRIP-qPCR C. 检测荧光素酶报告基因的mRNA表达水平:RT-qPCR D. 检测目标基因蛋白质表达水平:Western blot E. 检测细胞功能受到的影响:免疫荧光显微观察功能标志物测定... ... (4)研究目标基因的m6A甲基化如何影响目标基因表达 A. 检测m6A是否通过影响目标基因翻译而影响蛋白质水平:Polysome profiling、Ribo-seq,通过对结合核糖体上的mRNA进行定量,分析目标基因的蛋白翻译效率 B. 研究m6A是否通过调节mRNA的稳定性和降解而影响目标基因蛋白水平:研究m6A对目标基因mRNA水平的影响——RT-qPCR、RNA-seq C. 研究m6A是否通过调控RNA的出核(nuclear export)而影响目标基因蛋白水平:裂解细胞,超速离心分离细胞核与细胞质,然后分别进行RT-PCR实验检测细胞核与细胞质中的mRNA水平 (5)m6A修饰目标基因的表达回复实验 A. writers的突变/敲降/敲除实验:RT-PCR检测目标基因的mRNA水平变化、Western blot检测目标基因的蛋白水平变化、检测目标基因的功能 B. writers的突变/敲降/敲除后,目标基因的过表达回复实验:检测各项表型指数、细胞增殖、分化的回复情况 METTL3敲除后,靶基因Ezh2的蛋白表达受到影响。而靶基因Ezh2过表达回复实验会消除METTL3敲除对细胞增殖分化的不利影响 (6)研究特定m6A Readers通过结合目标基因RNA而影响目标基因的蛋白表达
以上就是易基因关于RNA甲基化研究的相关总结,有RNA甲基化(m5C、m6A)测序需求的老师可以联系我们哦! 相关阅读: 文献速递 | 通过m6A RNA甲基化修饰调节癌症中的端粒稳态和基因组稳定性 10分+文献详解|砷暴露与m6A RNA甲基化测序肿瘤研究结果高分见刊 独家分享:m6A peak鉴定经典点软件exomPeak原理解析 |
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