行业动态 | 抗体偶联药（ADC）开发的一般流程和关键考量因素mp.weixin.qq.com/s/YO-vQs8x3D-aB5oYeTAmOw
内容概要
化疗（Chemotherapy）是一种传统的癌症治疗方法，也是迄今为止最为有效且使用最广泛的方法。然而，由于化疗药物或疗法通常无靶向特性，所以在杀死癌细胞的同时也可能攻击正常组织和细胞，从而导致骨髓抑制、胃肠毒性、免疫抑制、内脏损伤、神经毒性等副作用。
抗体-药物偶联药（Antibody drug conjugates，ADCs）可以为抗癌药物安装上精确的“导航系统”，从而有效解决上述问题。ADC是将单克隆抗体药物（Monoclonal antibodies, mAbs）的高特异性和小分子化学药物的强细胞毒性相结合的药物，用以提高肿瘤药物的靶向性、减少毒副作用。一般而言，ADC药物由抗体（Antibody或mAb）、连接子（Linker）、细胞毒性药物（Cytotoxin，或称有效荷载（Payload））三个部分组成：通过mAb将药物输送至目标肿瘤细胞，使ACD获得高度的靶向性；Linker负责连接抗体和细胞毒性有效荷载；Payload负责杀伤肿瘤细胞。因此，ADC能够区分健康组织和病变组织，故能够在对健康细胞影响较小的前提下发挥最大疗效。本文简单介绍了ADC药物的结构特征、作用机制、开发方法、表征技术及监管策略。
知识要点
1、何谓ADC？基本结构及作用机理；2、ADC如何偶联？偶联方法及Linker的选择；3、ADC抗原和抗体如何选？目标抗原和抗体的选择方法；4、ADC如何表征？ADC开发中常用的检测方法；5、ADC药物如何监管？介绍不同监管部门的要求和职责。
简介
在过去的几十年中，癌症的药物和疗法得到了快速发展，放疗、化疗、基于小分子或单抗的靶向药物等治疗技术得到广泛应用。其中，传统的化疗药物一般通过通过抑制微管功能、DNA合成、抑制翻译后蛋白质合成等各种机制作用于癌细胞，抑制肿瘤细胞分裂、增殖或存活。然而，化疗的非靶向细胞毒性可能会引起严重的不良反应。
图 1 癌症治疗药物和方法的发展进程近年来，越来越多的人类癌细胞表面特异性抗原被发现，使得通过通过mAb靶向性治疗癌症方法成为可能。然而，由于mAb的分子尺寸较大，所以其主要缺点是会增加非预期的免疫原性反应风险。而且，由于其大尺寸和亲水性特征，一般难以穿透癌细胞的细胞膜，故其治疗效果较差。为了克服这些问题，可以引入了抗体介导的靶向递送技术或重组工程技术来克服这些问题，从而增强抗体的疗效。将Cytotoxin与mAb通过化学反应偶联起来，便可以针对特定疾病进行靶向给药，即所谓ADC药物。除了赋予化学药（Cytotoxin/Payload）靶向特性以外，mAb和Payload也可能产生协同的治疗作用。除了Payload自身的细胞毒性外，mAb也可通过以下三种主要机制特异性地性结合表面抗原并杀死肿瘤细胞：（a）通过阻断生长因子及其受体信号传导途径而诱导肿瘤细胞凋亡；（b）通过补体依赖性细胞毒性（Complement dependent cytotoxicity，CDC）调节T细胞功能，补体依赖性细胞介导的细胞毒性（complement dependent cellular cytotoxicity, CDCC）或抗体依赖性细胞毒性（Antibody dependent cell mediated cytotoxicity，ADCC）；（c）对肿瘤血管系统和基质细胞的抑制作用。
典型的ADC包括三个组成部分：mAb、Payload和Payload（图 2）。该技术提高了药物靶向癌细胞的能力，且可以有效改善高细胞毒性药物的靶向递送效率，扩大治疗窗口。
本文将全面总结ADC的开发过程和表征技术，以及其在技术和监管层面的挑战。
主要论述
何谓ADC?
ADC的结构
ADC包含单克隆抗体（mAbs）和细胞毒性剂（Cytotoxin，有效载荷（Payload）），二者以化学连接物（连接子，Linker）共价结合而形成ADC，其一般结构如图 2所示。
具体而言，在ADC的研究和开发中，人源化或全人单克隆抗体（Human monoclonal antibodies，hmAbs）是首选的药物递送介质，其可确保高度的细胞靶点特异性、长循环半衰期和低免疫原性。由于mAb对肿瘤特异性抗原具有高度的结合特异性，可以作为对肿瘤细胞有杀伤作用的有效载荷的载体。而且，人类肿瘤细胞中会过量表达一些独特的特异性抗原，一些mAbs可以识别和结合这些抗原，并诱导针对靶癌细胞的免疫反应，所以其本身也可作为单一药物用于癌症治疗。然而，由于mAbs导致细胞死亡的程度不同，所以其疗效往往受限，有时甚至可能无效。但是，将放射性同位素或细胞毒性药物（Payload）装载至mAbs上后便能克服抗体治疗效率不足的问题。
图 2 ADC的一般结构和作用机理ADC的作用机理
在设计ADC药物之前，需要仔细了解各组成部分在体内的作用机理（图 2）。理想的ADC应保持mAbs的特异性和靶向性，且能够有效地释放Payload以破坏肿瘤细胞。通常，静脉途径可防止胃酸条件、蛋白酶和肽酶等蛋白水解酶降解ADC中的mAb，所以更加适合ADC药物递送。而且，ADC中的mAb组分在血液中循环的存留时间更长，从而可以增强其与靶癌细胞中的特异性抗原的结合能力。
当ADC分子进入血液后，其中的mAb组分可以特异性地识别并结合靶癌细胞中高度表达的细胞表面抗原，形成ADC抗原复合物（Ag-Ab complex）。然后，复合物通过受体介导的内吞作用内化至细胞中。其中，网格蛋白介导的内吞起关键作用，最终复合物在其作用下形成初级内体。酸化的氢离子可以流入初级内体，从而能进一步加速ADC中的mAb与人类新生儿Fc受体（FcRns）之间的相互作用。该过程通过缓冲机制起作用，由于生理pH值7.4不适于ADC与细胞的结合过程，故可防止ADC错误地递送至正常的健康细胞。内体的表达主要受FcRn控制，未结合的FcRn受体直接形成内体，随后经溶酶体降解。结合ADC的内体也会在溶酶体内进行处理，进而在胞内释放生物活性形式的细胞毒性Payload（通常为抗有丝分裂剂）。释放的Payload可通过破坏胞内的DNA链或微管、抑制拓扑异构酶或RNA聚合酶、切割目的蛋白或者诱导凋亡等方式导致细胞死亡。因此，通常使用对癌细胞具有高效力而对正常细胞毒性较低的细胞毒性化学制剂作为Payload。此外，由于ADC中mAb与Payload通过Linker以化学共价键偶联在一起，Linker虽小，但其也是ADC中很重要的组成部分，可以保证ADC在循环系统的稳定性和良好的药代动力学特性，并能在肿瘤部位高效释放Payload，且Linker本身也应具有一定的稳定性。
简而言之，可将ADC视为抗肿瘤细胞毒性药物的精密递送系统。ADC在从血管运输至肿瘤组织中的靶分子的过程中会暴露在不同的条件下，故其细胞或分子水平上的作用模式较为复杂，每一步都具有一定的挑战性：
1、血液循环：ADC在血浆中循环时必须表现得像裸抗体一样。而且，Linker必须在血液中保持稳定，以避免其损害健康组织，而且能够通过高效分解或降解反应释放Payload，进而将后者运送至目标部位。
2、抗原结合：偶联的mAb必须保持较高的免疫亲和力。因此，将细胞毒性化合物连接至mAb后不得影响其结合特异性。为了避免干扰mAb的抗原识别作用，偶联位点应尽量避开mAb中与抗原结合的Fc或恒定区。
3、内化：必须达到足够的细胞内药物浓度。这通常较难，因为细胞表面的抗原靶点数量有限，故抗原-抗体复合物的内化效率一般较低。
4、药物释放：一旦内化后，ADC必须在肿瘤细胞内以其活性形式有效释放Payload。为了让Payload在释放后能够重新获得全部的细胞毒性能力，需开发可在靶点位置释放完整而无修饰形式的Payload的Linker。通常，Linker可能会影响Payload结构的稳定性，因此必须在血浆稳定性和在靶细胞中高效释放药物的能力之间寻找合适的平衡点。
5、细胞毒性作用：即使是在低浓度下，释放后的Payload的效力也必须足以杀死肿瘤细胞。为了获得足够的细胞毒性，必须使用IC50为亚纳摩尔级别的非常有效的药物。以细胞毒性物质作为独立的化疗剂进行试验时发现，ADC中Payload的候选物须为高毒性化合物，其细胞毒性为传统抗癌药物的100到1000倍。
此外，由于“3”和“4”的原因，通常需要将几种药物结合起来，而且还需要适当优化Payload的用量，以实现所需疗效。然而，如果抗体上附着了太多的细胞毒性分子，其可能会被机体识别为受损蛋白而被迅速清除。此外，采用多种药物可能会影响药代动力学，因此大多数情况下每个抗体会偶联2-4种药物以提供最佳的治疗窗口。
ADC如何偶联？
针对不同的病变细胞选择理想的靶向mAb和Payload是至关重要的，且Linker和偶联策略也是非常关键的开发内容。Linker以共价键偶联负责免疫应答的mAb和Payload，其分子结构和性质是ADC药代动力学、药效动力学和充足治疗窗口的基本决定因素。理想的ADC必须满足以下几个标准：
1、在Linker血浆中必须具有足够的稳定性，以保证ADC可以在循环系统中正常运输，而不会过早裂解，从而将Payload限制在肿瘤部位。如果过早释放，会使有细胞毒性的Payload损伤非靶细胞，引发不良反应。因此，有必要根据不同的抗原、肿瘤和Payload类型确定合适的Linker，并合理优化以提高其稳定性。
2、一旦ADC进入靶肿瘤细胞，Linker必须具备快速释放完整无修饰Payload的能力。
3、选择Linker时需考虑的另一个特性是疏水性。疏水性Linker与疏水性Payload的结合经常会促进ADC复合物的积累。
目前，已根据上述标准开发了一些Linker和偶联技术。其中，最常用的两种偶联技术为化学偶联法和酶偶联法，可以根据Payload的释放机制将连接子结构分为可裂解连接子（Cleavable linker）和非可裂解连接子（Non-cleavable linker）两大类。
图 3 ADC的一般开发方法偶联方法
化学偶联法
在化学偶联中，通过可控化学反应将mAb表面上的可用氨基酸残基与Linker上引入的反应柄连接起来，一般需要根据所选的偶联策略优化mAb与Payload的比例（Drug antibody ratios，DARs）和结合位点。
图 4 偶联位点影响ADC活性赖氨酸-酰胺偶联策略
赖氨酸-酰胺偶联策略是一种非常有效的ADC偶联策略，其利用含羧酸酯的Linker将Payload与mAb中自由的赖氨酸残基连接在一起。常见的mAb分子上含有约80个赖氨酸残基，其中约有10个可用于化学偶联反应。通常，通过这种方式会产生多种具有不同DAR和偶联位点的ADC分子。然而，DAR会影响ADC的PK/PD和细胞毒性，其中有几个对Ag-Ab相互作用不利的赖氨酸残基，在偶联后可能会发生改变。此外，虽然FDA已经批准了几种基于赖氨酸的ADC，但通过该偶联策略所得ADC的结合亲和力较低。因此，在赖氨酸-酰胺偶联中需要控制合适的DAR和合理优化偶联方式，以开发符合需求的ADC分子。
半胱氨酸偶联策略
半胱氨酸偶联策略是基于mAb的半胱氨酸残基与Payload上引入的硫代反应官能团之间的反应将二者结合起来。通常，mAb中所有半胱氨酸残基均形成二硫键，因此无游离巯基。人类ADC中最常用的mAb是IgG1，含有4个链间和12个链内二硫键。其中，一般仅4个链间二硫键能在可控条件下被选择性地还原。因此，由于巯基的数量有限，所以通过这种方式偶联的位点较少，所涉及的反应较明确。相较于赖氨酸-酰胺偶联策略，半胱氨酸偶联策略在异质性和DAR的控制方面表现更佳，所产生的ADC更高效，且治疗窗口更宽。
此外，将活性钯膦络合物与芳基卤化物混合而制成芳基钯试剂，能快速有选择性地与抗体的还原半胱氨酸残基发生巯基芳基化反应，从而可有效控制DAR。运用该方法所得芳基半胱氨酸偶联物的稳定性更高，对外部添加的硫醇、氧化剂、碱和酸的敏感度更低。
非天然氨基酸偶联策略
无论上述传统偶联策略的可控性如何，皆无法直接使用，仍需要进行大量的优化。通过引入乙酰苯丙氨酸等非天然氨基酸残基可以根据需求对特定位点进行化学偶联，从而能够更加高效地控制DAR。不过，该策略也存在一个缺点，非天然氨基酸可能会诱发不良免疫反应。
酶学偶联法
与化学偶联法一样，各种酶也被用于偶联细胞毒性Payload与mAb，其可选择性地修饰抗体中的结合氨基酸序列和对应的功能基团。运用该方法可以实现特异性位点偶联，从而能更有效地控制DAR。
转肽酶偶联策略
转肽酶/分选酶（Sortase）是从金黄色葡萄球菌中分离出来的一种酶，可用于转肽反应介导的偶联。Sortase能特异性地识别蛋白中的LPXTG（X：任何氨基酸）序列，专一性地切割苏氨酸-甘氨酸（T-G）结合位点，形成酰基酶-底物复合物，N端带有多聚甘氨酸的亲核基团进攻复合物，最终形成偶联产物。运用该方法可通过化学计量学方法控制特异性偶联位点和DAR，且不会对抗体与相应抗原的结合作用产生不利影响。
图 5 转肽酶/分选酶（Sortase）及转肽反应微生物转谷氨酰胺酶偶联策略
微生物转谷氨酰胺酶（Microbial transglutaminase，MTGase）亦可催化转肽反应，其主要催化蛋白质或多肽中谷氨酰胺上的酰胺与其它伯胺之间的酰基转移反应，参与蛋白质与蛋白质或小分子之间交联形成异肽键。因此，TGase可以将Payload与脱糖mAb中特定谷氨酰胺（Q295）进行共价偶联而形成ADC。
图 6 微生物转谷氨酰胺酶（MTGase）及其转肽反应基于氮葡聚糖工程技术的偶联策略
此外，还可采用基于β-1,4-半乳糖基转移酶（β-1,4-galactosyltransferase，GalT）和α-2，6-唾液酸转移酶（α-2,6-sialyltransferase，SialT）的氮葡聚糖（N-Glycan）工程技术进行偶联。
在体外，可利用半乳糖基和唾液酸转移酶的酶促反应引入末端唾液酸。这些唾液酸可经高碘酸盐氧化产生醛基，并进一步通过肟键与Payload共价偶联。
该技术的主要优点在于：无论N-Glycan的异质性如何，该策略皆具有较高的可重复性，因此可用于含各种N-Glycan的任何mAb与Payload的偶联。
图 7 基于氮聚糖工程（N-Glycan Engineering）的偶联策略链接子如何选？
连接子（Linker）在ADC结果中起着至关重要的作用，其会影响ADC的药代动力学参数、治疗指数和药效。Linker可维持ADC复合物在血流中的稳定性，并最大限度地减少非靶向效应。而且，在肿瘤细胞内化ADC的过程中，Linker应能够快速释放细胞毒性药物。此外，DAR是ADC开发中一个非常关键的参数，因此非常有必要通过结合位点的优化解决药效、稳定性和药代动力学参数相关问题，常见ADC的DAR接近4。可根据可裂解性质对Linker进行分类，即可裂解Linker和非可裂解Linker。
可裂解Linker
可裂解Linker可进一步分为三种类型：腙、二硫化物和肽Linker。在肿瘤特异性细胞内环境中，每种Linker表现不同：分别为低pH敏感性、谷胱甘肽敏感性和蛋白酶敏感性。
酸敏感性腙Linker在癌细胞内体和溶酶体的低pH（4-6）下容易发生酸水解，这有利于有效释放Payload。
二硫键Linker在血液循环中具有良好的稳定性，它们利用癌细胞内较高浓度的谷胱甘肽进行释放。癌细胞富含谷胱甘肽，这与肿瘤细胞生长和缺氧所导致的高度应激状态相关。
另一种形式的可裂解Linker是溶酶体蛋白酶敏感肽，例如：组织蛋白酶B可作用于在肿瘤细胞内切割ADC的二肽键的肿瘤特异性蛋白酶；缬氨酸瓜氨酸是一种组织蛋白酶B敏感型二肽；β-葡萄糖醛酸酶是一种在许多肿瘤中过量表达的酶，β-葡萄糖醛酸对该酶较敏感，可被其降解和水解，故可将β-葡萄糖醛酸作为蛋白酶敏感的Linker用于选择性地释放Payload。
图 8 肿瘤微环境对药物释放的影响非可裂解Linker
非可裂解Linker包括不可降解的硫醚或马来酰亚胺己酰基（Maleimidocaproyl，MC），其在ADC中Payload内化至靶癌细胞后经溶酶体酶降解。例如，Kadcyla是FDA批准的ADC，其中maytansinoid毒素通过不可降解MC Linker与mAb连接。
Linker和偶联技术仍在持续快速发展，各种新的高效Linker不断涌现。例如： Syntarga是由SpaceLink Technology和Syntagra BV开发的一种高度灵活的基于Linker的ADC，其Linker与Payload可逆偶联。
合理选择和优化Linker及其与Payload的偶联策略可有效提高ADC的治疗效果和减少脱靶效应。
ADC抗原和抗体如何选？
目标抗原如何选？
靶抗原的选择是ADC开发成功的主要因素，理想的靶点应具备以下特点：
1、靶点是肿瘤细胞特异性的，不会出现于健康组织细胞；
2、抗原应在配体存在下通过内吞作用内化，并应可再循环至质膜；
3、肿瘤微环境中抗原表达均匀，但循环系统中抗原的可及率低。
因此，ADC应具有靶向特异性，且副作用最小。仅在癌细胞中表达，而不会在正常健康细胞中表达。尤其在实体瘤治疗中，肿瘤体积大且具有一定的异质性，此为肿瘤治疗中最大的挑战。因此，需要对抗原进行优化，以增强肿瘤细胞抗原对特定靶点的内化作用。
一般而言，内化效率取决于靶细胞类型、抗体性质和抗原表位特征。无论配体如何，大部分抗原都分布在细胞外表面，少有抗原会被内化。不过，抗原内化作用并非诱导治疗效果所必需的条件。这是因为，二硫键连接的ADC会在实体肿瘤部位的内皮下细胞外基质上被还原，从而可增加肿瘤血管附近Payload的积累，使药物扩散至肿瘤组织块中。此外，靶向肿瘤抗原的另一个挑战是物理和动力学屏障，即：与抗原异质性表达和间质肿瘤细内高压力相关的旁侧效应（Bystander effect）。旁侧效应使得Payload从肿瘤细胞内部扩散至邻近健康细胞，从而对其产生不良影响。
抗体如何选？
抗体的选择是ADC开发中的另一个重要步骤，理想的抗体应具备五大特征：
1、高抗原亲和力；
2、靶向特异性；
3、在循环系统中的保留时间足够长；
4、尽可能避免免疫原性反应；
5、尽可能防止免疫交叉反应。
具体而言，理想的抗体应具有0.1-1 nM范围内的结合亲和力。第一代ADC中一般使用小鼠抗体，但其会引起严重的免疫原性反应。为了克服这个问题，通过生物工程学研究开发了各种嵌合、人源化、完全人类抗体等。目前，在ADC的开发过程中主要使用人源化或完全人类抗体。在人源化抗体中，要么将小鼠互补决定区（Complementarity determining regions，CDR）重新表面化，要么直接移植至人Fv表面。临床试验中，大多数ADC由人类免疫球蛋白G（IgG）组成，尤其是IgG1。
ADC如何表征？
ADC复合物由mAb、Linker和Payload三部分组成，故其分子性质较为复杂，需要采用多种分析方法进行表征。
一般需要采用基于分离的技术表征ADC的单体含量、游离药物和载药能力，例如：尺寸排阻色谱法（Size-exclusion chromatography，SEC）、反相色谱法（Reversed-phase chromatography，RPC）、疏水相互作用色谱法（Hydrophobic interaction chromatography，HIC）等。此外，质谱（Mass Spectroscopy，MS）可用于识别细微的分子结构变化；SEC可用于对挥发性流动相中的ADC进行脱盐；在稳定性研究期间还可采用SEC检测ADC片段；运用电喷雾电离质谱（Electrospray Ionisation Mass Spectrometry，ESI-MS）技术可识别基于半胱氨酸偶联技术的ADC的载药分布，其优点在于可更准确地观察分子离子或准分子离子；通过液质联用（Liquid Chromatography Coupled Mass Spectroscopy，LCMS）与RPC相结合的方法可确认偶联类型和DAR。通常，LCMS技术用于Fc结构域中含有保守N-低聚糖的还原或非还原性ADC的分析，以减少异质性。
RPC和HIC为基于分子疏水性的分离方法。其中，RPC用于确定药物负荷、药物分布和异质性，量化分析ADC混合物中的游离药物、ADC在不同储存条件下的稳定性以及表征通过重链或轻链附着到药物Linker上的mAb。与RPC类似，HIC是另一种用于表征ADC疏水性的分析技术，DAR较高的ADC表现出高疏水性，可通过HIC进行表征。
此外，亲水性相互作用色谱（Hydrophilic interaction chromatography，HILIC）是一种比反相液相色谱更有效的亚单位水平免疫结合物表征技术，运用LC-MS与HILIC相结合的方法可表征ADC的Payload和聚糖修饰；肽图分析法（Peptide mapping）是研究特定ADC荷药分布的另一种工具，多用于研究蛋白质分子的一级结构和确定蛋白质分子内表面暴露的表位；酶法通常用于去除Fc结构域中的保守N-低聚糖；生物分析测定法用于评估释放的游离药物、抗体总量和DAR；ELISA是定量与mAbs相偶联的Payload的经典方法；MS用于测定游离药物的浓度；基于特定配体的分析方法用于了解ADC的特异性结构，可作为早期筛选技术；电化学发光技术已用于表征完整ADC分子的结合能力。
图 9 基于LC-MS的ADC分析方法ADC如何监管？
根据美国食品和药物管理局（Food And Drug Administration，FDA）要求，ADC药物需根据生物许可证申请（Biological License Applications，BLA）流程进行审批。
通常，mAb在生物制剂评价和研究中心（Center for Biologics Evaluation and Research，CBER）进行评估，ADC在FDA药物评价和研究中心（Center for Drug Evaluation and Research，CDER）进行评估。自2003年以来，二者均在CDER进行评估和审查。实际上，在ADC的申请审批过程中，需要对mAb、Linker和Payload三种主要原液（Drug substances，DSs）进行质量表征，所有相关的信息和数据均需要在申请文件中的化学、制造和控制（Chemistry, Manufacturing, and Control，CMC）部分呈现。FDA的审查过程主要由生物制品办公室（Office of Biological Products，OBP）和新药质量评估办公室（Office of New Drug Quality Assessment，ONDQA）执行，OBP负责审查和监管mAb及细胞库相关的生产流程，ONDQA负责审查和监管Payload和Linker等小分子组分相关的生产流程（图 10）。
图 10 ADC药物申请审批中的监管职责分配ONDQA对ADC的监管要求
根据ONDQA的要求，若所产材料是最终的DS，则需对Payload和Linker进行表征，表征指标包括：旋光性、手性、分子多态性、杂质（产品相关、工艺相关、游离药物及其相关物质、残留溶剂、重金属）等、生物活性（靶向特异性结合作用、结合亲和力、效应功能）以及药物效力。
通常认为，Linker和细胞毒性药物Payload为起始材料，Linker与Payload（Liner-Payload）的组合为中间体，ADC为最终DS。一般还需表征各种起始原材料的来源，包括：Linker和Payload的来源；微生物等发酵相关原材料的来源；对天然产物、肽和化学合成化合物进行结构修饰时所产生的半合成化合物等。而且，还必须表征所有起始材料相关的杂质，并开发可控的流程去除或减少杂质。此外，还需运用紫外光谱、红外光谱、核磁共振光谱、质谱和元素分析法等多种标准技术来表征Linker、Payload和Linker-Payload偶联物的结构。
如上所述，为了确定产品中的杂质，必须通过稳定性相关数据验证相应的纯度分析方法，并且对Linker与Payload偶联过程中可能产生的杂质进行分析。必须开发减少或去除杂质的工艺，并通过已验证的方法确定最终产品中的杂质残留。对于ADC的三种组分中的任意一种组分，含量高于0.1%均需进行结构表征。
OBP对ADC的监管要求
从OBP监管的角度，若mAb是最终的DS，mAb中间物与ADC的表征、质量控制和临床前和临床材料表现评估方面的监管要求均相同。因此，mAb的表征包括一级结构（氨基酸组成、N端/C端序列分析、肽图谱）、构象结构（分子大小和电荷异质体、分子量）、翻译后修饰（唾液酸水平、单糖含量和寡糖分布）等方面的分析和评估，以确定是否存在片段、聚集体和电荷异质体，考察其对目标抗原的亲和力和特异性。mAb应具有效应功能，且能与Fcγ受体（FcgR）和新生儿Fc受体（FcRn）结合。另外，还应评估mAb中间体在靶细胞中对信号转导的影响；若一些mAb本身具有细胞毒性活性，也需进行相应的评估。据此，需开发表征方法来分析分析mAb的效应功能，若抗体亚型为IgG4则还需开发减少半抗的策略。
杂质方面，必须分析确定和表征mAb生产过程中的产品相关杂质（二聚体、多集体、降解物等）和工艺相关杂质（微生物污染物、宿主细胞蛋白（Host cell proteins，HCPs）、宿主细胞DNA等）相关杂质。其中，分子大小异质体和电荷异质体是常见的产品相关杂质。若存在杂质，则需对杂质的生物活性进行表征，并了解其对ADC在机体内活性的潜在影响。与mAb最终产品一样，需开发可专一性分析、鉴定和量化mAb工艺相关杂质的方法，并对其进行充分的验证。此外，还须开发病毒清除和宿主细胞量化方法。而且，需根据人体可能接受的最大剂量进行杂质评估，并且对工艺相关杂质的去除方法进行充分的验证。
ONDQA 与OBP的职责
在一名评审员的领导下，OBP和ONDQA共同评审ADC的原液（Drug substances，DSs）和成品（Drug products，DPs），具体审查内容如下：
ONDQA
从ONDQA角度，对ADC的DS进行审计中的考虑因素包括：结构识别和表征、杂质分析和污染控制。其中，药物分布（Drug distribution，或载药量（Loading））和DAR是ADC结构表征中非常重要的指标。DAR指的是与mAb结合的Payload的平均数量，其为ADC的一个重要属性。DAR值影响药物的疗效，载药量过低会降低效力，而载药量过高则会对药代动力学和细胞毒性产生不利影响。药物分布表示ADC中每个mAb结合数的分布情况，药物分布不同的ADC可能具有不同的药理学和毒理学特征。
Linker-Payload中间体是通过多步化学反应所得的产物，故必须确定其生产过程中的杂质及其形成机制和验证方法，据此确定DS中是否存在药物相关物质、游离毒素、残留溶剂和其它工艺相关杂质（催化剂、金属），并进行量化和制定详细的相关规范。
在开始一期临床试验和创新性药品（Investigational New Drug，IND）申报之前，应在临床前毒理学研究阶段对药物相关杂质进行鉴定。而且，必须通过上述方法证明临床前（IND-enabling）毒理学研究所用批次与临床材料之间的DAR和药物分布特征具有可比性。
FDA建议，在关键临床试验（三期临床）之前，必须对Linker-Payload中间体的杂质特征进行表征，且需对含量>0.1%的单个杂质进行结构鉴定。OBP和ONDQA一起审查ADC数据文件，主要关注点为ADC的纯度（游离药物、游离抗体）和效力（DAR、载药量分布）。
OBP
OBP主要关注ADC中的mAb组分，根据OBP指南，必须对mAb结构进行表征。肽图谱是用于表征mAb中间体一级序列的技术，采用该方法比较游离mAb，以确定结合位点。同时，也采用该方法分析ADC的批间一致性。ADC中间体中的mAb组分还有的其它一些关键参数，包括：电荷、分子大小、糖基化、抗原结合和其它生物学活性。 偶联工艺对这些参数具有重要作用，故必须谨慎评估和描述这些属性。根据Linker的基本化学性质，可基于电荷和分子大小分离ADC。例如：采用半胱氨酸偶联法不会改变mAb的电荷异质性。
还需要运用针对游离mAb的纯度分析方法来表征ADC组分，例如：SEC-HPLC、SDS-PAGE/CGE和电荷异质性分析方法等。若mAb发生任何变化，必须进行相应的可比性研究。而且，还需对分析方法进行充分验证，以评估不同的临床和商业化（若已上市）批次所产样品的毒理学性质。尽管一般主要关注Linker-Payload部分的变化，但也必须对游离mAb与结合Linker-Payload的mAb进行比较，据此评估载药量的变化。
小编总结：在过去的几年中，ADC的结构优化、方法开发和作用机制研究方面取得了很大的进展，有望克服传统抗体药物的不足，发掘抗体药物的新应用方向，通过ADC技术提高抗体相关药物的疗效。因此，本文讨论了ADC的基本概念、结构特征、作用机制以及开发ADC药物的各种偶联/连接技术和监管策略。
目前，对传统化疗药物的耐药机制和非特异性靶向作用的了解仍相当有限，但通过ADC的特异性靶向作用可以有效规避这些问题，故ADC在抗癌治疗方面具有巨大的潜力。不过，ADC包括Payload、Linker和mAb三个组成部分，这使得其结构较传统抗体更为复杂，从而增加了分子开发的难度。
因此，ADC的开发中存在一些挑战。首先，非预期细胞毒性问题有待解决。与传统化疗药物相比，尽管ADC大大提高了靶向效率，但仅少量的ADC会聚集至肿瘤中。其危险性在于，Payload的毒性通常是常规化疗药物的成百上千倍，而Linker在正常细胞中不一定绝对稳定，若在正常组织中非特异性地释放Payload，则可能导致系统性不良反应和降低最大耐受剂量（Maximum tolerated dose，MTD），这极大地限制了ADC的治疗潜力。未来，可以设计更多更多选择性更强的Linker，既可在肿瘤组织中快速释放Payload，又能有效降低药物对正常组织的非靶向毒性。而且，ADC也可能导致耐药性。ADC产生耐药性的详细机制尚未确定，可能的原因包括：靶抗原下调、ADC内化减少、Payload外流等。另外，ADC中通常使用全长mAb，实体瘤渗透受限和内吞效率受限的问题在所难免。一方面，可以使用更小的纳米抗体来提高效率；另一方面，也可采用具有细胞外释放能力的Linker来突破这些限制。最后，Linker的结构相对较复杂，这给临床前研究和临床应用带来了困难。因此，开发结构简单、功能完整的Linker可能是未来一个重要的研究方向。
综上所述，ADC的开发过程涉及的知识面较广，为了开发更为理想和有效的ADC分子，不仅需要对传统抗体的特性和生产过程有深刻的了解，还需要了解其潜在的生物化学、免疫学、药理作用和分子方面的知识，据此选择合适的靶抗原、mAb、Paylaod、Linker和偶联技术，并进行合理优化，以克服各种稳定性问题和药效问题和应对未来各种复杂的癌症。相信在不久的将来，随着抗体技术、连接器技术和新型有效载荷的持续发展，终将开发出具有更加精准的靶向性和更强大的肿瘤细胞毒性功效的理想ADC，以促进肿瘤治疗技术的发展。
参考资料
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