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目前，间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells, MSC）主要来源于骨髓、脐带、脂肪以及羊膜等四种组织。其中，MSC在脐带中的含量最高，羊膜和脂肪次之。同时，脐带来源的MSC不管是增殖能力、免疫调节能力还是细胞因子分泌能力均优于其他三种组织。在我国，脐带属于医疗废弃物，所以脐带的获取较为容易。 脐带的组织结构略为简单，长40-60cm，外面包绕着一层羊膜，基质中包含三条血管（一条静脉和两条动脉）。今天，为大家奉上脐带分离原代MSC细胞的操作方法。 一、实验前准备 1、仪器设备与供试材料 仪器设备：超净工作台一台、二氧化碳培养箱一台、1mL电动移液枪。 供试材料：脐带。 2、用品 无菌产品：1xPBS数瓶、完全培养基、双抗、止血钳2把、眼科镊子（直头）3把、眼科镊子（弯头）3把、眼科手术刀3把、眼科手术剪3把、移液管（10 mL）数支、圆形无菌培养皿（100 mm）、圆形无菌培养皿（150 mm）、TC处理的滤盖细胞培养瓶（75 cm2）、长枪头（1mL）、离心管（50 mL）。 其他用品：离心管架、废液缸等。 二、实验操作 1、脐带处理 a. 将新鲜脐带组织放在150mm培养皿中，倒入加有双抗的DPBS溶液，没过脐带即可。使用止血钳向下挤出淤血，需更换DPBS、重复操作3-4次，尽量将淤血清理干净。 b. 用手术剪剪成2-3cm小段放入新鲜DPBS中，如仍有淤血残留，使用上一步骤相同的方法将淤血清理干净，直到脐带中的淤血全部清理干净为止。 c. 在100 mm的培养皿中倒入1ml左右完全培养基，以便为脐带提供一个湿润的环境。取一段脐带，寻找到两根脐动脉和一根脐静脉所在之处。用手术剪剪开脐带，将静脉血管的粘膜清除干净，然后清除动脉血管。 d. 将处理好的脐带用眼科镊子剪成细条状，然后用眼科手术刀切成或者用眼科手术剪剪成小块，呈匀浆状。 e. 将脐带匀浆转移至50ml离心管中，加入完全培养基直至没过组织匀浆。 f. 在T75细胞培养瓶中加入4mL完全培养基，使得培养基能够完全覆盖整个细胞培养瓶底面即可。剪去长枪头（1mL）的前端，将剪碎的组织块平均转移至已加入培养的T75培养瓶内（每瓶约1ml外植体，大约1个/cm2）。轻轻晃动培养瓶，使组织块均匀分布，置于CO2培养箱内，期间不要晃动培养瓶，避免组织块脱落。 2、换液 a. 3天（72h）后换液。换液时稍微将培养瓶倾斜，移去原有培养基，仅保留1mL原有培养基，再添加4ml新鲜的培养基。 b. 每3天换液一次。通常情况下，培养7-8天左右，即可观察到细胞爬出，14天左右仍未爬出细胞的组织块可舍弃。 c. 当爬出的细胞覆盖细胞培养瓶至90%左右，即可进行原代细胞的传代。 3、传代 a. 将培养瓶置于工作台上，前后左右轻晃多次。期间保持培养瓶水平置于台面上，此时大部分组织块会掉落。如仍有未掉落的组织块，建议用移液管或枪头戳走或吸走。 b. 可收集脱落的组织块，进行菌检、支原体检测等。 c. 将培养瓶内培养基移除干净，沿着对侧瓶壁（避免将细胞冲落）倒入10mL左右DPBS，轻轻晃动，清洗细胞两次。 d. 吸去残留液体，加入1.5mL胰酶（0.05%），并均匀铺开胰酶，放入37℃培养箱，消化约1min，并将细胞培养瓶置于显微镜下观察。直到观察发现细胞变圆分离时，加入10mL新鲜培养基终止消化。 e. 使用移液管吹打几次，将细胞悬液移入15mL离心管中，210g室温离心4min。移去上清液，加入完全培养基重悬细胞并进行细胞计数。 f. 为能尽快获得更多的细胞，建议以较低的密度进行接种。 |
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