『线上答疑』双十Q&A新品Seahorse XF 底物氧化压力测试试剂

Seahorse2020年新品XF 底物氧化压力测试

标准实验   XF 底物氧化压力测试

XF 长链脂肪酸氧化压力测试试剂盒

XF 葡萄糖/丙酮酸氧化压力测试试剂盒

XF 谷氨酰胺氧化压力测试试剂

进阶实验   XF 棕榈酸酯氧化压力测试

XF 棕榈酸酯氧化压力测试试剂盒

新品Seahorse XF 底物氧化压力测试试剂常见问题双十解答

1.这些分析适用于我的细胞类型吗?

绝大部分细胞类型是适用的。底物氧化压力测试的基础是 XF 细胞线粒体压力，它已成功地用于多种细胞类型，包括细胞系和原代细胞。

划重点：请访问安捷伦细胞分析出版物数据库，搜索出版物中使用的细胞类型。

2.这些分析适用于悬浮细胞、原代细胞和/或免疫细胞吗？

是。但是，请确保目标细胞类型遵循适当的实验和分析程序。

3.我需要优化细胞接种密度吗？

是。如需了解有关细胞密度优化基本流程的更多信息，请访问 XF 分析学习中心和安捷伦细胞分析出版物数据库。

注意：对于高级棕榈酸酯氧化压力测试，如果对细胞进行底物限制，则可能需要降低细胞接种密度，因为这一步骤需要额外一天的细胞培养。

4.我需要优化 FCCP 浓度吗？

是。对于标准底物氧化压力测试，如果目标细胞类型之前进行过细胞线粒体压力测试，则 FCCP 浓度可能与线粒体压力测试所用的 FCCP 浓度相同。

划重点：

对于高级棕榈酸酯氧化压力测试，由于分析培养基中存在BSA，可能需要增加 FCCP 的浓度。

此步骤应该在最初的高级棕榈酸酯氧化压力测试之前或期间进行。请访问 XF 分析学习中心和安捷伦细胞分析出版物数据库，了解有关 FCCP 优化基本流程的更多信息。

5.如何确定抑制剂是否为最佳浓度？

每种抑制剂的最佳浓度均基于安捷伦的测试以及分别在以下参考文献中提供的乙莫克舍、 UK5099 和 BPTES 信息：

(1) Divakaruni et al.2018；(2) Hildyard et al.2005；(3) Robinson et al.2007.

6.如果对抑制剂没有响应说明什么？

从生物学上讲，这表明在所确定的实验条件下，细胞对该底物没有需求或依赖。

注意，在基础呼吸条件下 （如底物需求较低的条件下），对这些抑制剂的响应通常较低或无响应。

7.我应该增加抑制剂的浓度吗？

不用。每种抑制剂都经过优化，以获得最佳的最终浓度：4 µmol/L 乙莫克舍，2 µmol/L UK5099 和 3 µmol/L BPTES。增加抑制剂的浓度，特别是乙莫克舍，将导致 脱靶效应，包括影响线粒体呼吸。

8.长链脂肪酸氧化压力测试和棕榈酸酯氧化压力测试有什么区别？

长链脂肪酸氧化压力测试是 3 种标准底物氧化压力测试之一。其旨在测试在分析培养基中葡萄糖、丙酮酸和谷氨酰胺底物饱和的条件下，细胞对内源性 LCFA 的需求，尤其适合回答与 LCFAO 有关的底物需求和依赖性问题。高级棕榈酸酯氧化压力测试是在分析培养基中棕榈酸酯 （棕榈酸酯-BSA 的形式）和左旋肉碱饱和，而葡萄糖、丙酮酸和谷氨酰胺底物供应有限的条件下进行。当实验设计要求细胞仅氧化长链脂肪酸（如棕榈酸酯）以研究干预措施对长链脂肪酸氧化过程的特异性影响时，本测试尤其适用。

注意：对于高级棕榈酸酯氧化压力测试，由于分析培养基中存在 BSA，可能需要增加 FCCP 的浓度。此步骤应该在最初的高级棕榈酸酯氧化压力测试之前或期间进行。请访问 XF 分析学习中心和安 捷伦细胞分析出版物数据库，了解有关 FCCP 优化基本流程的更多信息。

9.何时使用标准分析工作流程？    

标准底物氧化分析旨在回答以下类型的问题： 

· 细胞对特定的底物有需求吗？ 

· 细胞是高度依赖于特定的底物，还是其他底物也能满足细胞的需求？

· 如果对细胞实施遗传操控或药物暴露等干预措施，线粒体底物需求和/或依赖性将受到何种影响？

10.标准 LCFA 分析的 LCFA 来源是什么？

长链脂肪酸来源于细胞内源性脂质/LCFA，因此与细胞类型有关。

11.我是否可以/应该在标准底物氧化压力测试分析中添加棕榈酸酯-BSA （提供 FA）？

标准底物氧化压力测试中不建议添加棕榈酸酯-BSA，因为先前的研究表明，在充分补充的细胞培养基和随后在 XF 分析培养基中葡萄糖、丙酮酸和谷氨酰胺浓度饱和的条件下，细胞通常不会对外源棕榈酸酯作出响应。在相同条件下，添加棕榈酸酯的细胞对乙莫克舍的响应并没有增强。如需研究细胞对棕榈酸酯的氧化，推荐采用高级棕榈酸酯氧化压力测试分析。

12.我可以改变底物氧化压力测试分析培养基的成分（针对底物）吗？

建议从建议的底物浓度开始，以研究饱和底物浓度下的细胞行为。补充的葡萄糖、丙酮酸和谷氨酰胺的最终浓度可能会改变，但在设计实验和随后的数据解析时应谨慎。

13.这与 Seahorse XF 线粒体底物分析有何不同？

XF 底物氧化压力测试结合了底物通路特异性抑制剂和 XF 细胞线粒体压力测试 (MST)。基础呼吸速率和最大呼吸速率是 MST 报告线粒体功能的关键指标。在底物氧化背景下，基础呼吸速率，尤其是最大呼吸速率在很大程度上受到细胞对可用底物的运输能力和氧化能力的影响。因此，无论是在基础条件下还是在更高的底物需求 （最大呼吸，此时细胞更多地需求/依赖关键底物）下，该方法都非常适合于评估细胞底物氧化，并且也因此不同于 mFFT。

14.Seahorse XF 线粒体底物分析 (mFFT) 参数（依赖性、灵活性、容量）是否适用于此？

不适用。mFFT 定量参数不适用于这些分析。标准和高级底物氧化压力测试均采用公认的 MST 参数（基础呼吸、急性响应和最大呼吸）。然而，请注意，这里使用诸如底物需求和依赖性等术语来定性描述细胞和线粒体功能。

15.可以同时加入两种（或更多）抑制剂吗？

建议从使用单一抑制剂来研究细胞行为开始。同一组细胞可以使用两种或两种以上的抑制剂，但在设计实验和随后的数据解析时应谨慎。

16.何时使用高级分析？ 

高级分析旨在回答以下类型的问题：细胞的干预措施（如遗传操控或药物暴露）如何特异性影响长链脂肪酸氧化？

17.对于我使用的细胞（高级流程），最佳营养缺失培养基成分是什么？

建议根据经验确定目标细胞类型的最佳营养缺失培养基成分和暴露时间。要测试的常见参数包括降低底物限制生长培养基中葡萄糖、丙酮酸、血清和 GlutaMAX 的浓度，以及在进行分析之前向细胞提供该底物限制生长培养基的时间长度。

18.棕榈酸酯浓度是否饱和？

是。当使用建议的浓度时，棕榈酸酯的浓度已饱和。

19.我可以/应该从 XF 棕榈酸酯氧化压力测试分析培养基中去除葡萄糖吗？

XF 棕榈酸酯氧化压力测 试分析培养基中的最终葡萄糖浓度应进行经验测试。不建议完全去除葡萄糖，因为细胞需要低浓度的葡萄糖来确保糖酵解和 TCA 循环的正常功能，这与棕榈酸酯的最佳氧化有关，并可能影响最佳氧化。

20.高级分析法可以应用于葡萄糖/丙酮酸和/或谷氨酰胺氧化吗？     

目前，高级分析方法仅适用于棕榈酸酯氧化压力测试试剂盒。在没有其他底物的情况下，可以应用高级分析法特异性研究葡萄糖/ 丙酮酸和/或谷氨酰胺氧化，但在底物限制生长培养基和/或底物限制分析培养基中将葡萄糖和/或谷氨酰胺降低到亚饱和水平时，葡萄糖和谷氨酰胺需求之间的潜在干扰可能很大。优化高级实验条件的初步建议包括在饱和和亚饱和值范围内交叉滴定葡萄糖和谷氨酰胺的浓度，以便进行初步分析。

声明：内容来源安捷伦细胞分析团队，数据供参考，可用于研究使用，不可用于诊断。