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开发不从外部带入遗传物质而改良基因组的新技术“TAQing2.0” 1 .主讲人: 小田有沙(东京大学研究生院综合文化研究科广域科学专业助教) 太田邦史(东京大学研究生院综合文化研究科广域科学专业教授/东京大学生物普遍性联合研究机构教授) 2 .发布要点: ◆基因组(注1 )重组诱发技术“TAQing系统”(注2 )可以高速改良涉及多个基因的复杂性状，开发出了不导入任何外来DNA或RNA就进行基因组育种的新技术“TAQing2.0”。 ◆本技术利用细胞膜贯通肽将具有DNA切断活性的蛋白质导入细胞内，可以大规模且随机地重组整个基因组。 ◆通过本技术，在不能进行生物交配(有性生殖)、不能通过通常交配育种的工业用微生物中，实现了性状的高效改良。 通过将该技术应用于各种生物，可以高效且高速地获取以往无法获得的新型作物品种和变异毒株。 另外，由于得到的改良株中不含有任何外来DNA，因此期待比以往的转基因生物更容易被社会接受。 3 .发布概述: 东京大学与三菱商事生命科学株式会社合作，成功开发出了不从外部带入遗传物质，大规模重组生物基因组DNA，加速生物功能改良的新技术“TAQing2.0”。 在有用的农作物和发酵性微生物的改良中，自古以来就使用了利用有性生殖机制进行交配的方法。 本技术不从外部导入基因，而是改变已经存在的遗传信息的组合，产生新的性状(性质和特征)。 这是一种社会上容易接受的基因组改良技术，在人类历史上长期使用，但有些生物因相乘而失去了繁衍后代的能力，这些生物无法通过杂交育种。 在本研究中，通过向细胞直接导入DNA切断酶，即使是缺乏有性生殖能力的生物种类，也可以诱发与自然界交配时产生的基因组重组过程相似的大规模基因组重组。 通过使用TAQing2.0，对于迄今为止难以通过杂交育种的工业用微生物，也可以高效地进行接近自然变异形式的基因组改良。 另外，从感染症创药研究的观点来看，在抗生素产生菌中应用TAQing2.0，可以有效利用与天然产物合成相关的休眠基因，可以创制新的抗生素先导化合物。 这有望成为未来应对新兴复兴传染病的手段之一。 4 .发布内容: 自古以来，人类利用有性生殖机制，取得了对人类有用的性质的品种。 在交配育种中，不需要从外部导入基因就可以改变DNA (基因组DNA )，获得有用的性状。 由于此时的基因组DNA的变化经过更新换代需要时间，因此存在生物改良需要非常长时间的根本课题。 另外，对于失去有性生殖功能的生物，不能使用杂交育种，只能通过放射线和药剂处理花费大量时间和劳力获得有用性状。 通过这次开发的TAQing2.0技术，成功克服了这些课题。 本研究小组迄今为止开发了诱发基因组重组的技术TAQing技术( Muramoto et al .，Nature Commun. 2018 )。 该技术在酵母细胞和植物(拟南芥)的细胞中导入DNA切断酶，同时多发地切断细胞内的DNA。 由此表明，可以诱发基因组DNA的大规模重组，随之可以迅速改良生物乙醇发酵性能等有用性状。 但是，在当初的TAQing技术中，需要通过质粒DNA等从外部导入DNA切断酶的基因。 因此，存在着不能适用于尚未建立基因导入系统的生物种类，以及得到的变异毒株需要作为转基因生物来处理等实用化时的课题。 在这次的实验中，我们使用了失去有性生殖能力的工业用酵母酿母(注3 )的细胞。 将按特定DNA序列切割DNA的酶(限制性内切酶(注4 ) TaqI和MboI等)，与通用的膜通透性肽混合，只需作用于缓冲液中的甲苯酵母细胞，即可在细胞内引起基因组DNA切割，成功诱发了大规模的基因组重组(图1 )。 研究了各种条件，通过细胞前培养的时期、缓冲液条件等的优化(盐浓度、pH范围的限定和两性离子性缓冲液的利用等)，同时开发了在维持细胞壁的状态下，将各种蛋白质和酶迅速输送到酵母细胞内的方法。 通过利用该技术，获得了多个伴随凝集性等表现型变化的变异毒株。 利用单分子DNA序列发生器等对得到的变异毒株进行全基因组分析，也获得了在实际导入的DNA切断酶的切断序列部位发生基因组重组的证据(图2 )。 此外，在取得这一成果的过程中，还成功地正确确定了迄今为止只大致明确的酿母的全部基因组序列。本研究小组将该改良型技术命名为TAQing2.0，目前正在扩大应用于其他生物种类。 TAQing2.0有望为扩大育种具有新有用性状的生物的可能性和探索新抗生素做出贡献。 5 .发表杂志和得到支助的研究经费: 杂志名称:在线版: 2月17日 论文标题: taqing 2.0 for genome re organization of asexual industrial yeasts by direct protein transfection 作者: Taishi Yasukawa，Arisa H. Oda，Takahiro Nakamura，Naohisa Masuo，Miki Tamura，Yuriko Yamasaki，Makoto Imura，Takatomi Yamada DOI编号: 10.1038/s42003-022-03093-6 URL:https://www./articles/s 42003-022-03093-6 本研究得到了JST CREST研究费( JPMJCR18S3)、AMED新兴复兴传染病研究基础创建事业( JP20wm0325003 )的资助。 6 .咨询处: <有关研究的事情> 东京大学研究生院综合文化研究科 教授太田邦史 邮编〒153-8902东京都目黑区驹场3-8-1 tel:03-5465-8834传真: 03-5465-8834 e-mail:kohta2[ at ] bio.c.u-Tokyo.AC.jp <新闻负责人> 东京大学教养学部等总务科宣传信息企划小组 邮编〒153-8902东京都目黑区驹场3-8-1 Tel:03-5454-6306 e-mail:koho-j yoho.c [ at ] GS.mail.u-Tokyo.AC.jp 科学技术振兴机构宣传科 邮编〒102-8666东京都千代田区四号町5番地3 tel:03-5214-8404传真: 03-5214-8432 电子邮件: jst koho [ at ] jst.go.jp <关于JST事业的事> 科技振兴机构战略研究推进部创新组 保田睦子 邮编〒102-0076东京都千代田区五番町7 k’s五号町 tel:03-3512-3524传真: 03-3222-2066 电子邮件: crest [ at ] jst.go.jp <有关AMED事业的事> 日本医疗研究开发机构 疾病基础研究事业部疾病基础研究科 新兴复兴传染病研究基础创生事业 tel:03-6870-2225传真: 03-6870-2243 电子邮件: j program [ at ] amed.go.jp 7 .术语解释: (注1 )基因组 描述某特定生物种类的最小单位的DNA信息。 每个细胞里都储存着含有基因组信息的DNA (基因组DNA )。 (注2 ) TAQing系统 2018年报道的在活细胞内导入多位点切断DNA的限制性内切酶等蛋白质，同时多发诱发基因组重组的技术( Muramoto et al .，Nature Commun.2018 )。 TAQing系统可以快速改良酵母细胞的生物乙醇发酵性能，以及拟南芥等植物的抗逆性和生物量等性状。 (注3 )酿母 第一次世界大战期间，酿母( Candida utilis )开始在德国用于确保蛋白质营养来源，现在被用作饮食饲料用酵母和营养辅助食品。 此外，其安全性由美国食品和药物管理局( FDA )通过通用记录安全( gras )认证，在世界各国被许多食品使用。 (注4 )限制酶 特异性识别4个碱基或6个碱基、或更长长度的DNA碱基序列而切断DNA的酶。 由于存在于部分细菌中，有限制感染细菌的噬菌体(感染细菌的病毒)增殖的作用，所以被称为限制酶。 由于限制性内切酶具有按固定序列切割DNA的性质，为重组DNA技术的发展做出了不可或缺的贡献。 8 .附件: 膜透性肽诱导限制性内切酶进入细胞 细胞内限制性内切酶切断基因 组DNA 纯化的限制性内切酶蛋白质
诱发基因组重组 图1 TAQing2.0系统概述
传统的TAQing系统将携带限制性内切酶基因的质粒DNA导入细胞并在细胞内表达，在细胞内部分诱导DNA断裂。 在TAQing2.0中，将纯化的限制性内切酶蛋白与膜通透性肽混合，直接输送到细胞内。 因此，可以在不吸收外源DNA的情况下诱发基因组重组。 另外，因为也容易适用于没有建立基因表达系统的生物，所以适用范围扩大。
图2 TAQing2.0制备的酿母变异毒株(左上、野生株； 右上，变异毒株AG4 )的显微图像(照片，比例尺:5m )和染色体构成(下段示意图) 通过这次开发的方法，可以像照片那样在维持细胞壁的状态下将任意的蛋白质导入细胞内。 将TAQing2.0应用于特拉酵母后，可以容易地获得凝集性和抗压能力等表现型发生变化的细胞株。 另外，照片所示的AG4在第ⅰ染色体和第ⅳ染色体之间发生了易位(染色体的切断·再结合)。 表明易位的切割点存在DNA切割酶的识别序列。 |
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