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Metabolites. 2021 Nov; 11(11): 756. Published online 2021 Oct 31. doi: 10.3390/metabo11110756 PMCID: PMC8621503 PMID: 34822414 Urinary Metabolic Markers of Bladder Cancer: A Reflection of the Tumor or the Response of the Body? Greta Petrella,1 Giorgia Ciufolini,1 Riccardo Vago,2,3 and Daniel Oscar Cicero1,* Leonardo Tenori, Academic Editor Author information Article notes Copyright and License information Disclaimer Go to:  膀胱癌的尿液代谢标志物：肿瘤的反射结果还是身体的反应？这项工作将回顾近年来关于膀胱癌的各种研究获得的代谢信息，特别注意在尿液中发现用于诊断和预后这种疾病的生物标志物。原则上，它们将能够补充膀胱镜检查，这是一种侵入性但如今不可替代的技术，或者在最好的情况下，可以取代它。我们将评估不同实验在生物标志物适应症中表现出的可重复性程度，并将尝试进行合成以获得更可能成为临床实践指南的共识列表。在进一步的分析中，我们将探究膀胱癌患者中这些失调代谢物的起源。为此，将尿液中测量的不平衡与肿瘤细胞或组织内已知的不平衡进行比较将是有帮助的。虽然尿液分析有时被认为是液体活检，因为它与膀胱壁中的肿瘤直接接触，但它含有来自身体所有器官和组织的代谢物，并且肿瘤通过哺乳动物中发现的最不透水的屏障与尿液分离。特异性和全身性反应之间的区别有助于更深入地了解疾病及其后果。 关键词： 膀胱癌， 代谢组学， 诊断， 预后， 全身反应 转到(G)： 1. 代谢组学，临床生物化学的另一个视角
代谢组学这个词来自古希腊语，meta-bàllo（μεταβάλλω），意思是转动，改变，转化。它结合了两个词：bàllo，一个动词，意思是启动，和metà，意思是超越。然而，正是亚里士多德的工作赋予了代谢这个词（μεταβολή）其科学价值、用途和相关性。在第一本物理学书中，他肯定地说："让我们把自然界存在的事物，无论是全部还是部分事物，都处于运动状态，作为我们研究的一个基本假设：这得到了经验的证明"[1]。他还在"代谢"这个词和概念中固定下来，即每个动作都是从某物到别物的变化。因此，对于古希腊人来说，"代谢"这个词代表了一种行为，即认识到变化来自以前隐藏的东西。因此，在亚里士多德科学的原始经验中，代谢组学的意义包括将自然视为一个不断转变的地方，在这个地方，变化的过程不是无效的，而是通过这种孜孜不倦的获取和克服工作而保存下来的。在轉化中，形式保留了新的和意想不到的表現的進展。 在亚里士多德的生物学研究2500多年后，代谢组学是一门被广泛认可的科学学科，旨在鉴定和量化细胞内和细胞外代谢物（分子量为1500 Da <的分子）的整个集合，反映了生命系统中复杂的生化反应网络的永久变化，以适应环境和病理事件。这包括血清，血浆，尿液，脑脊液，呼气，组织和生物提取物等生物流体中的测量[2]。总体而言，组学科学，如基因组学（基因），转录组学（mRNA），蛋白质组学（蛋白质）和代谢组学（代谢物）采用整体观点来研究分子如何组成细胞组织或生物体。所有这些技术的综合研究就是所谓的"系统生物学"。 表征复杂生化混合物的需求使得必须使用最先进的分析技术。通过这种方式，可以分析所有物理状态下的化合物，包括固体（组织，土壤和生物废物），液体（生物流体，废水和水）和气体（呼吸，烟雾和气味）。此外，还可以进行体内或体外研究。所有这些应用都是可能的，因为代谢组学使用广泛的仪器。然而，近年来，有三种技术被证明是应用最广泛的：核磁共振（NMR），气相色谱 - 质谱法（GC-MS）和液相色谱 - 质谱法（LC-MS）。这些技术可以定量各种有机化合物，包括脂质，氨基酸，糖，生物胺和有机酸。一些综述描述了它们的工作原理以及如何在代谢组学中使用[3，4，5，6]。通常强调差异和相对优势，但一些研究表明，将它们视为互补性更有益[3，4，5，6，7，8]。 尽管代谢组学的应用越来越多，但最领先和最令人兴奋的应用是指临床和生化领域。它假设代谢途径的扰动如何以及何时在表型改变中发生，并且可以代表诊断或预后领域的强大工具。 关于许多慢性或严重疾病病因的核心假设是它们的起源是遗传的。当最近的流行病学研究表明，许多死亡和疾病原因都源于环境[9，10]，以及微生物组[11]和表观基因组的重要性[12]时，这种模式已经开始改变。代谢组学提供了支持这种新观点的证据，因为它对理解细胞代谢[9，13]，微生物组及其对人类健康和疾病的影响做出了重大贡献[14，15]。因此，代谢组学有助于确定动脉粥样硬化、癌症和糖尿病等复杂疾病中许多意想不到的化学原因[9，16]。此外，这些研究表明，代谢物（内源性和外源性）在疾病发展，细胞信号传导和生理控制中的作用比以前预期的更为关键。因此，代谢组学可以干预许多疾病的诊断、预后和预防，正如文献中的许多例子所显示的那样[17]。 转到(G)： 2. 代谢组学与癌症癌症被认为是癌基因和肿瘤抑制基因的核和细胞质水平的遗传改变的结果。这一理论几乎被认为是一种教条，以至于美国国家癌症研究所指出"癌症是一种遗传性疾病 - 也就是说，它是由控制我们细胞运作方式的基因变化引起的，特别是它们如何生长和分裂"。在这种情况下，在细胞，组织和生物体中观察到的代谢变化是由这些遗传特征和细胞能量学的失调引起的[18]。 另一种观点导致了另一种对癌症的解释，即癌症是一种始于线粒体代谢功能障碍的疾病，从某种意义上说，这又回到了Otto Warburg的原始观察结果[19]。然而，最近的数据表明，线粒体代谢可以下调或上调，将肿瘤分为两种类型：氧化和非氧化[20]。从这个角度来看，代谢改变是影响癌症发展的遗传改变的原因。导致代谢改变的原因值得讨论，但潜在的候选者是：炎症增加和ROS形成。虽然我们还没有足够的证据来完全接受代谢理论或理解基因突变和代谢改变这两个因素在疾病起源中发挥作用的相对重要性，但代谢组学可以做出重大贡献。从遗传学的角度来看，癌症是一种极其复杂的疾病，因为基于与癌症相关的基因数量和成为肿瘤的突变组合数量的快速计算会产生超过一百万种不同的癌症基因型的数字。在分析代谢改变时，这种复杂性降低，通常限于三种途径：有氧糖酵解、谷氨酰胺溶解和单碳代谢[21]。在D. Wishart有意义的总结中："[...]底线是，虽然癌症作为一种遗传疾病看起来非常复杂，但癌症作为一种代谢性疾病似乎非常简单"[21]。这种情况为代谢组学提供了发现新的特定治疗靶点和诊断标志物的独特优势。 3 膀胱癌诊断的关键课题膀胱癌（BC）是最常见的尿路癌，也是全球死亡的主要原因，每年约有55万例新发病例和16万例死亡[22]。膀胱癌的发病率因所考虑的地理区域而异：与高发达国家相比，未发达国家的年龄标准化发病率（ASI）低三分之一。世界卫生组织（WHO）预测，由于预期寿命延长，近期病例和死亡人数将增加[23]。 BC包括广泛的组织学：尿路上皮癌（UC），代表膀胱肿瘤的大多数（~90-95%），鳞状细胞癌（SCC）（2-5%），腺癌（0.5-2%）和小细胞癌（<1%）。BC的危险因素包括职业因素、年龄、性别、种族、社会经济地位、个人健康、饮食和病原体感染[24，25，26]。BC肿瘤根据它们是否侵入逼尿肌（肌肉浸润性膀胱癌，MIBC）或不侵犯（非肌肉浸润性膀胱癌，NMIBC）分为两类。第一种病例存在较高的淋巴结或其他器官转移风险，但幸运的是，仅占BC诊断病例的25%[23]。NMIBC通常涉及成纤维细胞生长因子受体3（FGFR3）突变，产生复发率高但进展风险低的癌症。相比之下，MIBC和原位癌表现出TP53、RB转录核心加压药1（RB1）、erb-b2受体酪氨酸激酶2或PTEN的缺失或突变，导致转移性癌症[27]。最近观察到其中一些基因型与细胞表型之间存在联系，导致与低进展风险相关的细胞系呈现活化的氧化代谢状态，而与高风险相关的细胞系呈现非氧化状态和高糖酵解活性[28]。 对疑似BC的患者进行膀胱镜检查，膀胱镜检查是一种使用灵活范围和局部麻醉进行的侵入性内镜手术[29]。如果观察到红色扁平状或实体病变，则需要进行组织学评估，因为炎症性疾病等良性疾病可能与 BC 相似。经尿道膀胱肿瘤切除术（TURBT）或整个区域的切除术用于获取有关肿瘤组织学的信息。此外，可以对尿液中的细胞进行检查（细胞学检查）以检测遗漏的癌症。具有恶性外观的细胞提示膀胱癌性病变，需要膀胱镜检查和组织学检查。 转到(G)： 4. 膀胱癌代谢组学：三个悬而未决的问题引入代谢标志物以准确诊断BC及其进展风险可能会降低疾病管理成本并提高患者的生活质量[30]。用于诊断的非侵入性标志物的可用性也将提高患者对常规筛查的易感性，从而提高预防性诊断的有效性。因此，即使没有明显的症状，也必须使预防成为非侵入性的，从而提高效率。此外，对这些筛查可能导致的代谢不平衡的生化解释可以为开发更有效的疗法和监测治疗和疾病演变开辟新的机会。 代谢组学可能是实现这一目标的最合适方法。在BC的特殊情况下，肿瘤与尿液的直接接触使得这种液体中可能存在特定的生物标志物。已经发表了许多关于BC尿标志物的具体综述，证明了人们对该领域的巨大兴趣[31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41]。我们修订了关于尿液代谢组学和膀胱癌的大多数可用数据，以回答三个关键问题：（i）是否有可能使用尿液代谢谱来检测BC？（ii）在肯定答案的情况下，是什么代谢物导致了这种差异？（iii） 观察到的代谢失衡的起源是什么？ 我们可以通过分析尿液状况来诊断膀胱癌吗？关于在尿液中发现BC诊断代谢标志物的二十五篇论文已发表在文献中（表 1).几乎所有的研究都使用MS与气相色谱或液相色谱法一起定量代谢物。使用NMR的作品数量相对较少，反映了尿液作为生物流体的复杂性，因为它含有许多化合物和高度可变的成分。 表 1 用于发现BC诊断生物标志物的尿液代谢组学研究工作列表。在所有情况下，作者都得出结论，对应于BC的对照组的尿液代谢谱之间存在显着差异。这一一致结果表明，尿液对膀胱肿瘤引起的代谢变化足够敏感。然而，要被认为是疾病的生物标志物，其改变需要与该疾病特别相关。从这个角度来看，不同的研究使用了由患有其他病理的个体组成的对照组而不是健康受试者，这是相关的。 一个例子是试图区分BC和肾癌（KC）在尿液中引起的代谢特征，肾癌是两种发病率最高的泌尿系统癌症[49]。作者能够使用多变量分析对照组，BC组和KC组进行100%特异性和敏感性的分类。一项连续研究显示，138例BC患者的尿液特征与121人对照组（包括52例非恶性血尿（HU）患者）的代谢特征进行了鉴别[52]。这种区别尤其重要，因为血尿在BC省是一种普遍的疾病，可能构成诊断这种疾病的混杂因素[23]。最近的一项研究表明，在存在或不存在血尿的情况下，可以区分BC和肾细胞癌（RCC）患者[64]。Peng等人[53]发现，十种代谢物是BC患者与尿路感染（UTI）和HU受试者形成的对照组之间显着差异的原因。相反，未发现尿液代谢物可鉴别BC与前列腺癌（PCa）[68]。 哪些代谢物是导致尿路状况差异的原因？如果第一个问题有一致的肯定答案，那么每项研究中提出的标记物在大多数情况下彼此之间非常不同，这阻止了对哪些代谢物负责BC患者尿液代谢分化的明确共识。所有研究的综合结果表 1生成 352 个假定的 BC 尿液标志物列表，但在至少三项研究中仅发现 20 个 （6%） 具有显著改变的水平（表 2).即使是具有最显着共识的代谢物马尿酸，在不到一半的研究中也显示出浓度变化。变异方向的再现性也很差：只有八种代谢物（2%）在列表中表 2不同研究显示对照组和BC组之间存在相同的差异，进一步减少了共识列表。如果我们只考虑至少三项研究中提出的那些标志物，BC的发生可能会导致马尿酸和柠檬酸水平的降低以及乳酸，牛磺酸，缬氨酸，谷氨酰胺，组氨酸和赤藓糖醇的增加。 表 2 用于膀胱癌诊断的尿液代谢物在至少三项研究中被发现受到干扰。
a每个符号都指一项研究;"↑" "↓"符号分别代表癌症与健康对照组代谢物浓度的较高和较低变化;"？"：未报告变异方向。 这些令人失望的数字并不是应用于BC的代谢组学的独特特征。例如，在PCa中，从2015年到2020年发表的13项研究总共提出了179种不同的推定尿液生物标志物。其中，只有4项（2%）在至少3项研究中重复显示相同的变异[69]。结果之间缺乏一致性无疑是多因果关系的，在接下来的几章中，我们将解决一些影响结果可重复性的潜在问题。 4.2.1. 样本大小缺乏可重复性的一个可能原因是在实验中使用了小队列。已发表的代谢组学研究最常见的限制是分析的样本数量不足，因此，与过多的试点实验相比，群体研究的数量仍然微不足道。在代谢表型研究中，适当的样本量计算并不容易，因为它们具有自上而下的无假设特征（所谓的非靶向方法），使实验设置复杂化[70]。然而，结果缺乏可重复性应该是通过招募更多参与者来提高实验结果重要性的有力激励因素。 地理来源，经济地位，饮食不同研究之间关于受试者地理起源，经济地位和饮食的异质性可能有助于观察到的不同代谢变化。尿液的代谢组成强烈依赖于生活方式和饮食[71，72，73]，这两个因素与国家甚至采集样本的不同城市高度相关[72]。对来自5个欧洲国家的1391名受试者的2732份尿液样本的分析显示，代谢特征存在系统性差异，特别是在性别、国家以及经济状况方面[71]。即使社会经济地位的影响通常不那么明显，与该因素相关的两种主要代谢物变异是马嘌呤和柠檬酸盐的变异[71]，这两种化合物在不同研究中作为BC的生物标志物重复次数最多（表 2).有贫困风险的人群所消费的食物质量和数量的贫困可能会在一定程度上影响这些变化[71]，正如之前在巴西儿童中观察到的那样[74]。与饮食的关系可能成为一个重要的混杂因素，减损观察到的BC的变化。因此，所有参与代谢组学研究的人在采集样本之前必须遵循标准化饮食至少24小时[75]。 4.2.3. 对照组适当的对照组的定义具有挑战性，特别是当用作BC患者的参考时，因为他们构成了具有显着合并症的老年人群。男性BC发病率较高是定义对照组时要考虑的另一个特征。鉴于性别是泌尿成分最关键的决定因素之一[76]，如果考虑不充分，结果可能会有偏差。例如，女性尿柠檬酸浓度升高[77]，这种差异可以部分解释当男性多于对照组时观察到的BC组该代谢物水平的降低。在一项关于尿 BC 生物标志物的代谢组学研究中已经指出了性别和年龄匹配的重要性：色氨酸代谢、柠檬酸盐循环以及泛酸盐和 CoA 生物合成在很大程度上促成了个体间变异。在这种情况下，为了获得有意义的结果，作者继续进行年龄和性别严格匹配的队列[59]。 4.2.4. BC异质性疾病异质性也是一个强大的因素，在查看尿液生物标志物时可能导致不同的结果。BC是突变负担最高的疾病之一，仅次于肺癌和皮肤癌[78]。这种巨大的遗传变异性导致巨大的异质性，至少表现在五个不同的水平上：患者间（不同的受试者呈现具有不同基因型的肿瘤）;肿瘤内（原发性肿瘤的不同空间区域不具有相同的遗传改变）;肿瘤间（多个原发性肿瘤或转移部位之间的基因型差异）;循环（基于组织的标志物和循环标志物之间的差异）和时间（肿瘤随时间和/或治疗期间的遗传变化）[79]。 除了BC肿瘤基因型格局的复杂性和不稳定性外，癌细胞代谢本身也存在很大差异。它受环境信号的影响，主要由肿瘤微环境产生。氧气和营养物质水平的变化可诱导代谢异质性，并且由于营养物质的较高限制，细胞代谢表型在肿瘤进展过程中会进一步改变[80]。不同的研究可能搜索生物标志物，几乎就像它们表征了由于基因型和表型的所有这些变化而导致的不同疾病一样。例如，在一些研究中，NMIBC和MIBC患者被一起考虑，尽管他们的代谢特征预计会非常不同，如组织样本研究所示[81]。在MIBC中发现了三种主要途径的改变，包括增加类二十烷酸信号传导，增强NAD +的从头合成和增加血红素分解代谢。即使一项研究只考虑了这两种癌症类别中的一种，重要的是要注意，这些广泛的分类包括呈现不同阶段的癌症，因此代表了癌症进展的不同阶段。例如，观察到与低级别NMIBC患者相比，高级别NMIBC患者的尿液中色氨酸代谢上调[58]。在Alberice等人的研究中，提出了一系列针对该等级和分期的BC诊断标志物[82]。作者还考虑了患者分类的复发病例，并发现了BC稳定性特有的预后标志物。在这项工作中发现的差异表明，作为对照组，为代谢组学研究选择的患者组也应该是同质的。尽管在该领域仍然是一个悬而未决的问题，但在寻找通用BC尿生物标志物时，大型队列是调解上述异质性的唯一方法。 生物标记物鉴定、定量的技术课题生物流体中代谢物的鉴定和定量也面临一系列技术难题。LC-MS是这些非靶向研究中最分散的平台，检测器饱和度和基质效应等问题可能会改变特定样品的信号强度[83]。不使用标记标准品的化合物鉴定是另一个挑战。根据代谢组学标准倡议，这对应于2级鉴定（推定注释）;对于MS，科学界一致认为，将实验数据与真实的参考标准品直接比较对于使用MS数据进行1级鉴定至关重要。在以下研究中，只有极少数情况下获得1级表 1 [45，48，51]，而在所有其他基于LC-MS的分析中，代谢物结构测定仅是假定的，并且基于与MS文库或MS / MS数据的比较。这可能会增加对量化特征的实际化学结构的模糊性，并可能部分导致不同研究之间缺乏一致性。由准确识别和量化的代谢物组成的数据集在生化信息和诊断/预后目的的不同研究中产生更强大，因此更具可比性的结果。最近，通过协同使用核磁共振和UHPLC-HRMS，提出了实现这一目标的可能方法[83]。 这些失衡的生理起源是什么？虽然可重复性差，但试图通过尿液诊断BC存在的研究发现，由该疾病引起的这种生物流体的代谢特征发生了显着变化。然而，这些变化的起源仍在争论中。全身反应与肿瘤与尿液直接接触促进的代谢物交换的相对权重是多少？如果目的是诊断性的，那么确定哪种机制是观察到的改变的主要贡献者并不重要，但对于理解生化原因至关重要。 肿瘤与尿液的直接交换引用的大多数研究表 1接受"直接接触"理论，将尿液视为一种液体活检[43，44，46，49，52，53，54，55，58，59，60，61，62，63，66，67]。因此，尿代谢变异的所有生化解释都可以通过肿瘤细胞通路中的不平衡来解释。该理论预测尿上皮膜上代谢物交换升高。从历史上看，物质从尿液进入膀胱内层是用于解释疾病起源的第一个猜想。在19世纪后期，德国医生Rehn注意到苯胺染料行业的工人表现出患这种肿瘤的风险增加[84]，将BC转化为第一个已知的化学诱导的癌症。尿液浓缩致癌物质，可吸入、消耗或通过皮肤吸收，随后与尿路内膜接触[85]。所有这些物质都有一个共同点，即它们已经或可以代谢成高反应性亲电化合物[86]。它们随后攻击蛋白质和核酸中的电子缺乏位点，形成共价加合物或诱导诱变[87]。 了解尿液中的变化与肿瘤细胞内发生的变化是否相关的最佳策略是比较组织和尿液代谢组学结果。到目前为止，只有两部关于BC的著作探讨了这些相关性。Putluri等人发现组织和尿液中有25种代谢物被改变[47]，而Alberice等人使用固态和溶液NMR发现两种基质中的氨基酸，谷胱甘肽和牛磺酸代谢途径显着改变[82]。 组织和尿液改变的巧合不足以假设生物标志物的特异性。例如，在PCa患者的组织和尿液样本中，同时观察到柠檬酸盐水平降低以及亮氨酸、缬氨酸和牛磺酸水平升高，因此被假定为该癌症类型的特异性生物标志物[69]。然而，在BC的尿液代谢谱中观察到相同的变异模式，如表 2用于柠檬酸盐、缬氨酸和牛磺酸。在两项研究中，BC患者的尿液中也观察到亮氨酸升高[47，51]。特异性可能源于两种疾病特征中这些代谢物的不同定量改变。在这种情况下，有必要准确测量生物标志物的水平，增加评估的实验难度。 比较尿液和组织代谢谱的研究数量不足以确定这种生物流体的变化是否主要反映了肿瘤代谢失衡，从而确定代谢物交换是否足够有效。要做到这一点，化学物质必须通过我们体内最不透水的膜：尿路上皮。 肿瘤和尿液之间的不透水屏障尿路上皮构成尿腔和下层组织之间的界面。它由不同的层形成，从浅表和高度分化的多核伞形细胞，几层中间细胞和一层基底细胞。通过连接伞形细胞的紧密连接可防止物质的细胞旁扩散，将尿路上皮转化为尿液中存在的大多数物质的不可穿透的屏障[88]。糖胺聚糖（GAG）形成额外的带负电荷的层，进一步促进尿路上皮屏障功能[89]。这些特征产生最具抵抗力的人体屏障，保护血液免受危险细菌和高风险物质的侵害。 尿液成分与血浆有很大不同：尿液渗透压范围为50至1200 mosmol / kg，而血液为280-290 mosmol / kg;它的pH值在4.5到10之间，而血液的pH值为7.4;它含有高浓度的氨，尿素和毒素。尿液必须长时间储存，因此屏障的功能是防止高渗透性分子进入血液，从而导致渗透压，pH值和离子强度的有害变化[90]。尿路上皮渗透率的体外测量确定尿素、氨、水和质子值非常低[91，92]，这表明体内膀胱是阻止这些物质从尿液流向血液的极好屏障[93]。 肿瘤形成可以通过结构上改变腔表面膜来潜在地改变这种情况。例如，肿瘤细胞在化学致癌过程中可能无法分化，产生没有六角形亚结构的修饰膜[94]，同时离子通透性增加[95]。据推测，这种修饰对于腔内MIBC更为重要，因为有人认为这种癌症亚型可能源于伞形细胞的转化[96]。然而，腔内肿瘤显示出显著的基底-腔部可塑性，表明所有膀胱癌均源于基底干细胞[96]。 肿瘤-尿液代谢交换是否足够？由于一系列原因，很难令人信服地解释大多数仅援引"直接接触"理论的尿液代谢特征的改变。对用于膀胱内治疗的候选药物进行的研究表明，即使在存在膀胱肿瘤的情况下，大多数物质的尿路上皮通透性仍然很低。这种类型的治疗利用治疗剂直接进入尿道提供的膀胱，最大限度地增加肿瘤对膀胱的暴露，同时通过减少全身暴露来限制药物的毒性[97]。Shen等人测定了不同药物尿路上皮与粘膜下层界面处尿液浓度之间的比率[97]。具有显着亲脂性的化合物显示出高达0.5的值，但更极性的化合物如丝裂霉素c，阿霉素和5-氟尿苷显示比值为0.02-0.03。这些结果和文献中的其他结果[98，99]表明亲脂性是药物通过尿路上皮渗透的关键决定因素。大多数化合物列在表 2小而亲水的不具备有效穿过尿路上皮膜所需的理想特性。为了加强这一概念，应该注意的是，增强子经常需要充分渗透到膀胱内治疗中使用的药物中。最有希望的是脂质体、表面活性剂、纳米凝胶、EMDA、RITE和低能冲击波疗法[100]。这些策略强调，仅仅BC的存在并不能保证膀胱腔和肿瘤之间化合物的高效交换。 此外，肿瘤细胞代谢对尿液组成的显着影响在动物模型中更合理，其中肿瘤与宿主的质量比通常大于人类，肿瘤肿块与整个生物体之间的比例较低[101]。同时，对于那些在尿液组成中显示出小质量变化的代谢物，肿瘤的影响预计会更高。该量可以从不同研究中测量的平均尿液浓度和折叠变化来计算，如表 3.初步分析表明，BC患者中改变最多的代谢物也是尿液中最集中的代谢物之一。考虑到几乎所有研究都使用MS，这一结果令人惊讶，由于其高灵敏度，该技术不会将标记物的检测限制在高浓度化合物上。如果我们加上BC中为它们的改变而提出的高倍变化，我们得出结论，就质量而言，变化必须非常高才能解释预测结果。例如，为了将尿液中马尿酸盐和柠檬酸盐的量减少到平均观察到的程度，肿瘤细胞应分别在两个尿空隙之间消耗100和40mg。对于共识列表中的大多数代谢物（表 3). 表 3推定的BC尿液生物标志物及其BC组和对照组之间总质量的预测变化。
a肌酐的μM/mM值。bBC和正常受试者尿液之间的平均质量差异，并使用以下公式计算： ，其中 NR 是此表中报告的平均值;Cc是肌酐的平均浓度（14 mM）;Vu是平均尿量（0.3 L）;MW是代谢物分子量，FC是折叠变化。cM/24 小时。 分离肿瘤和尿液的有效屏障的存在以及低肿瘤与宿主质量比是质疑"直接接触"理论影响的两个雄辩理由。另一种机制更有可能促成表 3.最明显的一个涉及系统性反应。事实上，许多针对人类的早期研究未能发现早期和局部癌症患者的显著代谢变化，这强化了在大多数后续研究中观察到的变异不是因为癌症本身，而是由全身反应决定的表型的表现的可能性[101]。包括整个身体来解释BC在尿液中产生的变化，朝着Doru Paul最近建议的方向发展，他邀请用一种新的模式取代"肿瘤"范式，该范式侧重于整个"癌变"生物体[102]。 转到(G)： 5. "癌变"生物体的全身反应Al-Zhoughbi等人提出了一个关键概念，有助于概念化癌症在整个生物体中诱导的代谢变化，即所谓的肿瘤宏观环境[103，104]。根据作者的说法，由于三种类型的相互作用，肿瘤环境不断变化，不同于发送和接收信号的细胞类型以及细胞信号的空间分布。第一种类型涉及癌细胞与其自身表面的受体结合释放的配体。第二种旁分泌相互作用涉及局部生长因子和抑制剂，定义了肿瘤微环境。第三种类型需要通过血管生成形成的新血管系统进行内分泌信号传导，是癌症生长和进展的关键步骤。这种涉及宏观环境的机制允许癌细胞与其他器官和系统相互作用[103，104]。 内分泌信号传导解释了整个生物体如何与肿瘤一起参与发展疾病。为此，开发了一个复杂的系统性致病网络，允许分离的癌症组织与生物体的其余部分之间的通信。该网络产生共依赖性，肿瘤与整个生物体之间的相互作用诱导癌症诱导的全身病理网络（CISPN）的出现[102]。最近提出了6种全身性标志，每种标志都通过不同的CISPN建立，包括原发性肿瘤、骨髓和远端转移之间的联系、整体炎症、免疫抑制、导致恶病质的代谢变化、血栓形成倾向和神经内分泌变化[102]].以下章节将回顾其中一些以及与BC相关的不同合并症。在所有情况下，我们都试图总结不同代谢组学研究发现的结果，并且我们已经分析了哪些BC的拟议标记可能由于不同的全身反应而改变（方案 1).这种交叉检查尤其重要，因为BC患者是高度共病的人群，考虑到他们的年龄和其他疾病、吸烟和体力状态差的普遍高患病率[105]。
在单独的窗口中打开 方案 1 拟议的 BC 尿液生物标志物及其在全身反应中的潜在参与。缩写：CAC：恶病质，HYP：高血压，ImIn：免疫抑制，IRF：肾功能受损，SIR：全身炎症反应，TN：血栓形成网络，5-HIAA：5-羟基吲哚乙酸，PAGN：苯乙酰谷氨酰胺。 全身性炎症：马尿酸盐和乳酸大量证据表明全身炎症反应 （SIR） 与癌症患者的肿瘤学结局不佳有关。SIR相关血液学生物标志物被认为是BC患者复发和死亡风险分层的潜在信息来源[106]。这些生物标志物之一是中性粒细胞与绝对淋巴细胞的绝对比值（NLR），这与NMIBC患者的疾病复发和进展显著相关[107]，与NMIBC患者相比，在MIBC患者中观察到更高的NLR值[108]。 BC与全身炎症状态之间的共存无疑会在尿液代谢特征水平上产生影响。其中之一是宿主生态失调[109]，它改变了肠道微生物群的组成，并最终影响尿马粪酸盐含量[65，110]。这种修饰可能是BC患者尿液中观察到其浓度降低的主要原因之一[44，46，47，48，49，56，60，61，62，63，65]，正如炎症性肠病（IBD）、慢性氏病和溃疡性结肠炎所观察到的那样[111]].此外，唾液排泄水平与其他系统的功能状态有关，包括排泄系统、心血管系统和神经系统[112]。毫不奇怪，在20种类型的癌症中发现尿马脓液有显著改变，可以安全地认为是肿瘤类型特异性最低的代谢物[113]。 BC 尿乳酸升高 [50，51，56，61，63] 也可与 SIR 相关。Pietzner及其同事发现，泌尿乳酸盐与白细胞计数（WBC）之间存在正相关[114]，白细胞计数是临床实践中用于评估炎症程度的实验室标志物之一。缺氧条件和免疫细胞增殖的高能量需求导致乳酸在炎症部位积聚[76]。该代谢物还调节T细胞的促炎反应，并诱导这些细胞在炎症部位的捕获[115]。 免疫抑制：马尿酸盐和乳酸免疫系统的抑制和炎症的诱导是肿瘤生长和进展的两个决定因素[116]。转移性肿瘤细胞在其表面上释放含有程序性死亡配体1（PD-L1）的外泌体。用IFN-γ刺激可提高PD-L1水平，抑制CD8 T细胞功能并促进肿瘤生长[116]。在BC的特异性病例中，几项试验显示检查点抑制剂的疗效令人鼓舞，均靶向PD1/PD-L1通路[117]。然而，超过半数的晚期疾病患者在此类治疗中未显示出临床获益[118]。因此，有必要找到可以预测对免疫治疗反应的标志物。 至于炎症，免疫系统和肠道微生物组之间存在相互干扰[119，120]。这种关系导致微生物群和/或其代谢物可能影响免疫检查点抑制剂的疗效[121，122，123，124]。Hatae等人的工作证明，当预测非小细胞肺癌患者的高反应时，来自微生物组的马粪酸盐和其他三种代谢物非常有价值[125]。虽然没有关于这个主题的研究，但BC患者的尿水平可能在未来用于预测他们对免疫治疗的反应。 一些小组强调了乳酸作为癌症患者免疫抑制剂的作用。乳酸水平升高是肿瘤微环境酸中毒的主要因素。细胞外环境中pH值降低会损害CD8+和CD4+淋巴细胞的功能（活化、细胞毒性、趋化性、运动性和增殖）[126，127]。Brand等人已经描述了在免疫抑制中调节乳酸介导的活性的机制：乳酸产生和随后的酸中毒抑制活化T细胞（NFAT）的核因子，激活CD8 + T细胞和NK细胞中的转录因子。因此，IFNg的产生减少，IFNg是一种在先天性和适应性免疫活性中起关键作用的细胞因子[128，129]。 高血压：马尿酸盐，柠檬酸盐，琥珀酸盐一项使用国家健康保险研究数据集的全国性基于人群的队列研究确定高血压与BC次级发展之间存在正相关关系[130]。高血压可减少马尿酸盐排泄，正如来自中国、日本、英国和美国的人群样本中关于尿液代谢物表型的研究所证实的那样[131]。通过自发观察高血压大鼠的尿液代谢组，已经建立了马尿排泄与血压之间的进一步关联[132]。 柠檬酸盐和琥珀酸盐是三羧酸循环（TCA）的中间体，它们在BC患者尿液中的水平降低通常被解释为肿瘤细胞中糖酵解与OxPhos的相对权重的变化[43，44，50，51，52，56，60，61，62].然而，它们在全身代谢中的作用超出了它们在TCA中的功能。在血管、心肌细胞和肾上皮中发现了琥珀酸盐特异性G蛋白偶联受体[133，134]，表明琥珀酸盐可以作为细胞外信号分子。尿柠檬酸盐螯合物游离Ca2+，从而防止钙2+草酸盐结晶和肾和膀胱结石的形成。肾结石的形成与发生高血压的风险增加有关[135]，Khamaysi等人认为这两种疾病状态之间存在分子联系，因为蛋白质复合物介导并调节柠檬酸盐和琥珀酸盐的转运，第一种与肾结石形成有关，第二种与高血压有关[136]].此外，在接受根治性膀胱切除术（RC）和随后的尿液转移的患者中，尿枸橼酸盐浓度可以改变，这在膀胱内治疗失败后常规用于治疗高危NMIBC或治疗MIBC[137]。在此类手术患者中，肾结石形成的发生率相对较高，导致尿枸橼酸盐水平下降[137]。综上所述，这些结果表明，TCA以外的全身通路严重影响这两种代谢物的尿浓度。 肾功能受损：苯乙酰谷氨酰胺，牛磺酸和酪氨酸高达40%的膀胱癌患者也存在肾功能损害[138]。与肾功能正常的受试者相比，在严重肾功能损害中，苯乙酰谷氨酰胺（PAGN）肾清除率降低了5倍[139]。PAGN浓度与肾功能不全之间的联系是基于这样一个事实，即在人类中，苯乙酸（PAA）和谷氨酰胺结合形成PAGN从血浆中的45%增加到尿液中的90%。这些数值表明，50%的尿液PAGN来自游离血浆PAA的肾脏偶联和/或肾脏对偶联PAA的优先滤过[140]。考虑到这些数据，在不同的BC尿代谢组学研究中观察到的尿PAGN降低[46，49，60，63]可能与这种合并症部分相关。 牛磺酸是第一种作为BC生物标志物提出的代谢物[44]。其他研究证实，该化合物在BC患者[78，89，99，100]和PCa患者的尿液中增加[69]，这排除了其作为特异性BC生物标志物的定义。一项关于急性心力衰竭患者的尿液代谢组学分析的研究发现，牛磺酸是检测早期肾损伤的最重要变量[141]。需要更多的证据来分离牛磺酸排泄中由于BC和肾功能损害引起的协变，以确定其尿液紊乱的原因。 在3项研究中，观察到BC患者尿液中酪氨酸增加，1项研究中酪氨酸减少[47，56，60，63]。在正常男性和女性的尿液中，酪氨酸和苯丙氨酸均少量排泄，但在晚期肾功能衰竭患者中，这两种氨基酸的清除率与肾小球滤过率的比率增加[142]。这种效应可以部分归因于在尿酪氨酸水平中观察到的变化。 正如Van等人已经指出的那样，这些例子表明，在定义BC引起的尿代谢特征时，消除肾脏疾病和其他尿路合并症的影响的重要性[143]。 血栓形成网路：柠檬酸盐、缬氨酸至少20%的癌症患者在一生中会经历血栓形成事件，血栓栓塞被认为是门诊化疗患者死亡的主要原因[144]。事实上，静脉血栓栓塞（VTE）可能是本应被视为健康的个体隐匿性肿瘤的首发表现[145]。癌症和血栓形成之间的相互联系已经存在了一个多世纪，这取决于这样一个事实，即一方面，癌细胞支持凝块的形成，另一方面，凝血蛋白促进癌症的生长和扩散[145]。恶性肿瘤诱导高凝状态的主要机制涉及跨膜糖蛋白组织因子（TF），其通过与细胞表面凝血因子VII/VIIa的相互作用激活凝血级联反应[146]。 BC患者VTE的风险特别高，转移性疾病患者的发病率为每100例患者年7.9例[147]。接受RC治疗并存在TF阳性肿瘤的患者死于疾病的风险是TF阴性患者的3倍[148]。 几项代谢组学研究试图阐明血栓形成的分子基础[149]。最常显示水平改变的代谢物是乙酸盐，柠檬酸盐，葡萄糖，苯丙氨酸，缬氨酸和3-羟基丁酸盐。与上述分析的病例一样，至少有两种代谢物属于BC共识清单表 2，柠檬酸盐和缬氨酸，也作为这种全身效应的生物标志物的候选者出现。 恶病质和肌肉减少症：乙酰肉碱，肉碱，柠檬酸盐，肌酸，谷氨酰胺，乳酸，琥珀酸盐，牛磺酸，酪氨酸，尿苷和缬氨酸癌细胞表现出改变的新陈代谢，特别适合获得足够的能量和高代谢更新率。这种高能量来自肿瘤生化途径，但在整个生物体上也建立了"代谢独裁"，以应对对底物的需求[150]。通过这种方式，在不同的组织，肿瘤，肌肉和脂肪以及器官（包括肝脏，胰腺，大脑和肠道）之间建立网络[151]。该网络配置了一种称为恶病质的全局综合征，该综合征在癌症患者中发病率较高，并且与炎症直接相关：细胞因子如IL-6，TNF-α，IL-1β和TGF-β诱导炎症和脂肪组织消耗[152，153]。 与肝脏和脂肪量减少但瘦体重不瘦的饥饿不同，癌症恶病质的特征是瘦体重（肌肉减少症）的丧失，伴或不伴脂肪量损失[154]。肌肉减少症在BC省的预后作用是近年来几项研究的主题。一般而言，观察到肌肉减少症与接受RC或晚期BC无法手术的患者预后不良有关[155，156]。代谢方面，肌肉减少症与葡萄糖、脂质和蛋白质代谢有关[157]。实验证据表明，这些代谢改变源于肿瘤诱导的宿主代谢变化，而不是肿瘤本身的代谢活动[101]。 Yang等人分析了癌症恶病质、预恶病质（体重减轻<5%）、体重稳定型癌症和健康对照组患者的血清和尿液代谢特征，发现45种代谢物是导致所有这些组间差异的原因[158]。9种代谢物的指示表 2因为BC的生物标志物与Yang等人在研究中列出的生物标志物一致：肉碱，柠檬酸盐，肌酸，谷氨酰胺，乳酸，琥珀酸盐，酪氨酸，尿苷和缬氨酸。例如，测试组之间的乳酸水平不同：体重稳定的癌症组相对于健康和癌症恶病质组，乳酸水平均升高，但低于恶病质前组[158]。事实上，乳酸浓度显示出这些变化，使其成为一种非常不特异性的标志物，并且在体重稳定性或体重减轻方面高度依赖于BC组的组成。 在另一项研究中，Stretch等人使用代谢组学来预测晚期癌症患者的骨骼肌和脂肪量变化[159]。他们列出了一系列对照组，以将癌症特异性代谢判别因素与与瘦肉和脂肪质量变异相关的代谢差异区分开来。受试者必须进入禁食状态，对蛋白质摄入量进行分层，或在测量前提供标准化的蛋白质摄入量，并分为预定义的瘦肉和脂肪量[159]。正如Yang等人的研究一样，许多代谢物来自表 2被发现与体重的变化有关，包括乙酰肉碱，牛磺酸，肌酸，琥珀酸盐，乳酸和酪氨酸。 转到(G)： 6. 结语尽管人们非常期待使用尿液作为发现BC标志物的特别受欢迎的生物流液，但尚未发现该生物体液中拟改变的代谢物或代谢物组具有足够的敏感性和特异性来替代膀胱镜检查进行BC诊断[160，161，162]。尽管与其他疾病的研究相比，研究的数量仍然很低，但这并不是唯一的缺点。本综述讨论了这种失败背后的一些问题。必须注意标准化组的组成，其地理来源和饮食，考虑的肿瘤类型，并精细调整技术细节。关于实施NMR和基于MS的代谢组学的一系列方法学建议可以在Dinges等人的综述中找到[113]。 关于BC引起的尿液代谢特征变化的最终原因，我们强调了"癌变"身体的全身反应。该分析补充了大多数代谢组学BC论文的解释，主要基于直接反映在尿液中的肿瘤生化失衡。虽然肿瘤和尿液之间代谢物交换的贡献可以对低浓度化合物起重要作用，但近年来观察到的代谢水平变化的大小和对癌症的大量紧密关联的全身反应增加了全身反应的可能性。当追求对癌症代谢途径的生物学理解时，必须同时考虑肿瘤代谢和全身反应，以合理化观察到的代谢变异。然而，这可能还不够，将结果与其他组学领域（如基因组学、转录组学和蛋白质组学）以及不同类型的样品（如组织和血清）相结合可能至关重要。 寻找特定代谢物，其改变代表肿瘤细胞内发生的事情将需要将注意力集中在浓度较低和特异性较高的化合物上。事实上，使用尿液作为液体活检的概念主要是指检测无细胞肿瘤核酸和其他肿瘤衍生物质[163]。另一种方法是使用含有miRNA和IncRNA的尿细胞外囊泡，这有望获得诊断性生物标志物[164]。在这种情况下，代谢组学的作用还有待发现。 Quandt等人回顾了使用肿瘤活检与外周生物标志物在癌症免疫治疗临床决策中的应用中的大多数"利弊"[165]。它们非常适合评估使用尿液发现BC生物标志物的潜力和缺点。组织活检是黄金标准，因为它们允许对感兴趣的原发部位进行原位分析，并提供肿瘤微环境的空间分辨率。相反，该方法是高度侵入性的;患者通常不适合进行必要的外科手术;需要进行连续评估，结果严重依赖于肿瘤异质性。外周生物流体，如血清或尿液，可以通过微创手术提供标志物;连续评估很容易;它们可以在整个生命周期内受到监控;样品以较低的成本制备，并且患者和健康志愿者可以轻松获得材料。它们反映的系统特征可以缓解肿瘤异质性，因为全局反应可以是同质化特征。有许多缺点，包括缺乏空间分辨率，缺乏对生物流体反映宿主 - 肿瘤相互作用或全局系统后果的程度以及它们是否真正代表肿瘤异质性的知识。最后一个约束可能是根据BC患者的代谢特征为其寻找最佳治疗方法时的限制。 通过将非侵入性生物标志物引入NMIBC治疗和随访的常规临床实践中，可以预见到疾病管理的新范式。它包括改善早期诊断、预后、选择有效治疗和在整个生命周期内的随访（方案 2).主要的好处将是降低治疗和随访的成本，并且由于这些标志物的非侵入性特征，对患者的生活质量产生积极影响。考虑到COVID-19大流行导致的实际紧急情况，纳入这些药物具有更大的意义，这导致膀胱镜检查的等待时间大幅增加，延误了诊断并降低了监测质量[166]。因此，有人提出，尿液生物标志物在诊断和预后中的作用必须扩大其在疾病管理中的作用[167]。对于从事代谢组学工作的科学家来说，发现可以取代当前金标准测试或提高其选择性的尿液代谢标志物仍然是一个重大挑战。除其他障碍外，弥合基础研究与临床实践之间的差距仍然是一个需要克服的巨大障碍，这是加倍努力的最重要的方向。
在单独的窗口中打开 方案 2 一种新的NMIBC管理范式，利用非侵入性代谢生物标志物作为当前临床实践指南的补充[168]。缩写：BCG：Bacillus Calmette-Guèrin，TURBT：膀胱肿瘤的经尿道切除术。 转到(G)： 作者贡献 |
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