 已知RNA中存在数百种修饰，以真核生物为例，5’端帽子和3’端Poly(A)修饰在整个转录调控环节中扮演重要的作用，mRNA的内部修饰也在维持整体稳定性上扮演着重要的作用。这些内部修饰中最常见的主要是N6-腺苷酸甲基化、N1-腺苷酸甲基化、胞嘧啶羟基化也就是经常被提到的m6A、m1A和m5C。这三者中的m6A更是现在研究的热点。 m6A的概念  图1 RNA中的常见修饰 m6A修饰是真核细胞中常见的修饰，在不改变碱基序列的前提下，对RNA的转录、剪接、翻译等过程起到调控作用。整个修饰过程普遍认为是动态的、可逆的，能够影响mRNA的代谢并调控RNA的转录、输出、剪接、降解和翻译。m6A的整体过程基于三个组件进行分别为“Writers”、“Readers”、“Erasers”。 01 m6A甲基化转移酶（Writers）：一种蛋白质复合物，分子量较大，可以达到1MDa，主要组成部分为METTL3、METTL14以及以WTAP为代表的一些辅酶因子，当然伴随着研究的进行，已经发现不局限于METTL家族的相关蛋白，也存在其他蛋白可以行使Writers的功能。 02 m6A甲基化阅读蛋白（Readers）：一种RNA结合蛋白，能够影响发生m6A修饰的mRNA行使特定的生物学功能。对于Readers的鉴定主要通过RNA pull-down，鉴定表示其主要为YTH结构域蛋白家族主要也是包括YTHDF和YTHDC。二者也已经有相应研究表明可以通过与起始因子相互作用或特异性识别修饰等方式来达到对mRNA的调控。 03 m6A去甲基酶（Erasers）：有甲基化的添加肯定会有甲基化的去除，这些就依赖于去甲基酶的作用，现研究表明主要是FTO和ALKBH5两种。其中FTO的发现也证明了m6A修饰过程的可逆、动态。  图2 m6A过程示意图 m6A的检测方式 m6A的检测方式多种多样，从上世纪70世纪第一次发现RNA中的m6A开始，就陆陆续续有多种检测技术的诞生，但是很多技术都被实验设备和工具等显著，没有广泛的进行。2012年才首次出现使用高通量技术去鉴定人和小鼠m6A甲基化水平的文章，二者也先后发表在Nature和Cell上。使用的方法也就是MeRIP-seq或现在普遍称呼的m6A-seq。其基本原理其实就是通过m6A抗体与m6A的mRNA片段结合，再进行测序，最高可以达到100nt的分辨率。 2015年在MeRIP-seq的基础上也有可以做到单碱基分辨率的miCLIP-seq方法的出现，但是实验中存在同位素添加等过程，无疑提高了实验成本和操作的难度，所以实际去进行的实验室并不多。 现在对于m6A修饰也涌现了很多新方法，其中具有代表性的就是Direct RNA测序，通过独特的建库方式，依托算法，可以达到对RNA单碱基水平修饰信息的收集，这无疑是对m6A检测打开了另外一个方向。已经有研究利用Direct RNA 测序技术探究人、拟南芥等物种的m6A修饰，文章也陆续发表在Cell、Nature methods、advanced Science等高水平期刊上。  图3 Direct RNA研究基本路线 m6A研究文献精选 01  研究方式：CRISPR技术、m6A-seq、IP-qPCR 研究内容： 研究通过利用CRISPR技术构建了拟南芥FIONA1的突变体，并发现FIONA1是拟南芥U6 m6A甲基转移酶，课件m6A安装在U6 snRNA和一部分的Poly(A)和RNA中。同时研究发现，FIONA1的缺失会导致光敏色素信号识别紊乱以及光周期出现错误，从而引起下胚轴伸长和提前开花。与其他物种如哺乳动物中的METTL6不同，在正常或高水平 SAM 条件下，FIONA1 既不将 m6A 安装在拟南芥 SAM 合成酶的 mRNA 中，也不影响其转录水平。研究证实 FIONA1 可以在体外和体内甲基化植物 mRNA m6A 基序。进一步研究表明 FIONA1 在几个表型相关的转录本中安装 m6A，从而影响下游 mRNA 稳定性，并调节光敏色素信号传导和成花转变。  图4 成花的转变需要FIONA1的甲基化活性 02  研究方式：LC-MS/MS、Direct RNA-seq、IP-qPCR 研究内容： FIONA1蛋白定位于细胞核中，包含一个甲基转移酶功能域，是人METTL16的同源蛋白。该研究发现，缺失FIO1导致拟南芥整体m6A甲基化水平下降，并呈现出早花表型。通过Nanopore 纳米孔直接RNA测序，作者比对了FIO1突变体和野生型之间差异化的m6A修饰，共检测到3459个低甲基化位点且分布于2068个蛋白编码基因中。这些低甲基化位点主要集中在CDS（79.6%）偏向终止密码子区域。此外，作者还鉴定到一个独特的甲基化修饰模体YHm6AGA (Y = C/U; H = C/A/U)。这些特征明显区别于植物体内已知m6A甲基转移酶复合体呈现的特点。进一步的研究发现，FIONA1可在体外催化RNA的甲基化反应并且FIONA1的催化失活突变体不能挽救FIONA1的早花表型。这些结果表明，FIONA1的甲基转移酶活性是拟南芥开花调控所必不可少的。  图5 整体研究思路 上述两篇文献研究内容都是基于拟南芥的FloNA1开展，研究其对于甲基化的调控作用，以及调控后所带来的生物体变化，最后的结论也可以在一定程度上互相印证，虽然使用的研究方式各有不同，但是最后都能够达到识别甲基化修饰、验证甲基化调控的一个基本目的。这说明无论是m6A-seq或Direct RNA-seq都可以是m6A甲基化研究的重要工具。 m6A的研究依旧还是热点领域，植物方面无论是拟南芥这种模式生物或其他非模式生物的研究也越来越广泛，动物方面以小鼠为代表的研究也非常多，在基础医学、生物化学、动物科学等的研究也占据着一席之地。整体文章的发表情况相对也比较容易，对于有详实数据、完整生物学故事的m6A文章，基本都可以有一个较高层次的文章发表。 综上，无论是站在RNA转录调控整一个大的方向，还是现在对m6A修饰研究方式、方法的更新换代，RNA甲基化研究依然会在一段时间内保持相对高的热度。
|
|
|
