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作者 | 姬瑞 单位 | 榆林市第五医院  随着新冠疫情趋于常态化，核酸检测已成为人们生活中的一部分。为了监测“采样“、“提取、扩增”等环节，目前市场上多个产品均在核酸扩增试剂内加入了“内标”，包括“内源性内标”和“外源性内标”，两种方式各有利弊。 · 内源性内标可以在“单检”场景下检测到是否采集到了足够的人体细胞; · 外源性内标在检测中能够更好反映“提取”和“扩增”的效率，另外在“环境样本”检测中，能够更好的发现样本提取或者扩增效率不足的情况，从而提示检验人员警惕假阴性结果。 「内标」、「内源性内标」和「外源性内标」 PCR扩增靶标基因扩增呈现“阴性”，存在以下可能：①受试者为“真阴性”，②由于采样、提取和扩增阶段存在问题，导致的“假阴性”。 各个厂家为了减少“假阴性”的发生率，可通过检测内标核酸是否“起线”，判断是否存在“采样、提取、扩增”导致的假阴性。 内标分为“内源性内标”和“外源性内标”。内源性内标采用的是人的管家基因，存在于人的基因组中，可以监测核酸检测的全流程，包括取样、样本提取、PCR扩增过程。外源性内标采用的为非人源基因作为内标，是假病毒或质粒，在提取之前加入，监测核酸检测的样本提取、PCR扩增过程，不能监测取样过程[1]。两者的分析比较如下: 表 内源性内标与外源性内标的区别
「外源性内标」在核酸检测中能够更好反映提取、扩增效率 试验一： 在真实的新冠核酸筛查中，96孔的样本提取检测，可由于多种原因，出现单孔提取、扩增效率降低，甚至出现假阴性的情况。 本试验在单孔（B6孔）中降低磁珠用量，以模拟提取效率不足，进而观察“内源性”和“外源性”内标对提取环节的监测效果。
图1“内源性内标”扩增曲线图，B6孔提取样本Ct值并无明显异常
图2“外源性内标”扩增曲线图，B6孔提取样本Ct值明显高于其他样本，提示该样本可能存在提取或扩增效率不足的问题 所有使用“内源性内标”扩增的样本中，内标扩增的Ct值在18.8~31.2之间，B6孔提取样本Ct值为25.3，难以发现B6孔样本提取存在问题。这是因为“内源性内标”采用的是检测人体的“管家基因”，“管家基因”的核酸分子数量取决于采样情况，“内源性内标”的Ct值高，可能原因包括：采样不足，核酸提取、扩增效率较低[1]。 另一方面，使用“外源性内标”扩增样本中，除外B6孔样本，其他样本扩增的Ct值均较为集中，在30.9~31.8之间，重复性好。B6孔的提取样本Ct值为33.7，明显高于其他样本，提示B6孔的样本提取或扩增效率较低。 这是因为，“外源性内标”提前在反应体系中加入的定量“假病毒或质粒”，核酸分子量是较为稳定的。因此，当“外源性内标”Ct值较高时，因考虑核酸提取或者扩增效率不足，如果该样本靶标基因检测结果为阴性，应警惕“假阴性”可能。 外源性内标能反映“环境样本”中含抑制性物质 试验二： 《新型冠状病毒肺炎防控方案（第八版）》中提出，要采用“多渠道监测预警”，包括生物样本和环境样本的检测。提示，环境样本检测在疫情防控中也发挥着重要作用。但环境样本成本较为复杂，含有多种物质可抑制PCR扩增反应，导致结果假阴性。最常见的强抑制性物质是“腐植酸“，多见于泥土样本[2]。 该实验是采用泥土（含腐植酸）、灰尘样本；分别模拟含有强抑制物和不含抑制物的样本，分别采用“内源性”和“外源性内标”扩增试剂检测，评估两种内标的对样本中是否存在抑制物的监测能力。    
End◥ 来源 | 器审中心 |
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