斯坦福联手谷歌、英伟达，在NEJM发表罕见病研究| 天下武功，唯快不破

2022年初，由斯坦福大学研究团队主导的一项研究发表在《新英格兰医学杂志》（NEJM）通讯（Correspondence）栏目。在一长串的作者名单和单位中，谷歌（Google）和英伟达（Nvidia）赫然在列：谷歌为这项研究提供了云平台，芯片厂商Nvidia则提供了基因组分析软件。文章虽短小，却凝聚了不同领域科研人员的共同心血。

这项研究提出了一种可以精确快速对疾病作出基因诊断的超快速纳米孔基因组测序方法[1]，将对“快”的追求贯彻至全流程，从样本制备到数据分析，处处体现出节省时间的巧妙设计。

早有研究表明，快速基因诊断可以指导临床治疗，改善预后，降低费用[2]，但此前的全基因检测往往需要耗时数天甚至数周，而且还可能因为所用基因组合（gene panel）检测未包含突变基因而无法确诊。

超快速纳米孔基因组测序或许有助于改善基因诊断用时过长的困境。使用该技术，治疗团队为一因不明原因持续癫痫就诊的3月龄足月产患儿进行了全基因组测序，在编码酪蛋白激酶β亚基的CSNK2B基因鉴定出一种可能致病的杂合变异。患儿的癫痫症状包括右眼视偏伴双侧上肢阵挛抽搐和口周肌阵挛抽搐，发作间期脑电图显示大量主要位于后部的多灶性尖波，但脑磁共振成像未见异常。

根据基因检测结果和临床症状，该患儿被确诊为Poirier-Bienvenu神经发育综合征——一种以肌张力低、癫痫和发育迟缓为特征的疾病[3,4]，从获取患儿样品至初步的基因诊断结果出炉仅耗时8个多小时。随后，医疗护理团队为其提供了针对性的医疗咨询和疾病管理。

该患儿也进行了传统的癫痫基因组合检测，2周后终于拿到的结果显示，仅有多个诊断价值意义不明的基因变异被检出。

包括该患儿在内，2020年12月至2021年5月期间，作者在加利福尼亚州斯坦福的两家医院纳入了12名具有代表性的患者，并为其中的5名作出了初步基因诊断，从血样到达实验室到获得初步诊断的最短时间为7小时18分钟。初步诊断结果立即交予研究医师和临床医师复核，并就所检变异是否为导致患者临床表现的主要原因达成共识，从而在尽可能短的时间内实现对患者临床治疗的指导。

这场抢时间的战役是如何打响的？

该技术的整体工作流程结合了商业纳米孔测序的流水线式准备、分布式云计算生物信息学和自定义的变异序列优先排序方法。

超快速纳米孔基因组测序工作流程

这项技术的一大亮点在于对生物信息学框架的更新，允许在测序同时将TB级原始数据上传至云储存空间，并把数据分布到多台云计算器上，以实现实时碱基判定和比对，这一步骤使测序后分析时间从7小时21分钟缩短至34分钟，耗时减少93%。

整个流程的加快还体现在样本的制备上。出于对测序成本的考虑，测序流动槽（flow cells）会被反复清洗直至无法使用。为了避免上一个样本的残留，给不同样本的测序文库加上条形码（barcode）是常规的做法，但作者在完成7个样本的常规条码测序后，开始使用一种无条码方法快速生成基因序列，将样本制备时间减少了37分钟（至平均2.5小时）。无条码方法还允许在各测序流动槽中加入更大量的DNA（333 ng vs.155 ng）并提高孔占用率（从64%到82%）。

为了缩短测序时间，每个患者的DNA文库被平均分配到48个测序流动槽中同时测序，直到获取超过170 Gb的数据。在方法优化后，能够在1小时50分钟内产生高达200 Gb的数据。最终，12名患者的基因组测序产生的数据在173～236 Gb之间，与人类参考基因组GRCh37比对一致性达到94%，常染色体覆盖度为48～64×。

作者采用的超快速评分系统也通过对变异进行自定义过滤和优先排序，大幅减少了需要人工复核的候选变异的数量。科研人员将读取到的序列结果与GRCh37比对后，共找出了中位数为4,490,490个单核苷酸变异以及小的插入和缺失。超快速评分系统将需要人工复合的小型变异的数量缩减至中位29个（范围：16～53），结构变异的数目减少至中位22个（范围：11～37）。

参考文献

1. Gorzynski JE, Goenka SD, Shafin K, et al. Ultrarapid nanopore genome sequencing in a critical care setting. N Engl J Med 2022; 386:700-2.

2. Dimmock D, Caylor S, Waldman B, et al. Project Baby Bear: Rapid precision care incorporating rWGS in 5 California children's hospitals demonstrates improved clinical outcomes and reduced costs of care. Am J Hum Genet 2021;108:1231-8.

3. Poirier K, Hubert L, Viot G, et al. CSNK2B splice site mutations in patients cause intellectual disability with or without myoclonic epilepsy. Human Mutat 2017;38:932-41.

4. Wilke MVMB, Oliveira BM, Pereira A, Doriqui MJR, Kok F, Souza CFM. Two different presentations of de novo variants of CSNK2B: two case reports. J Med Case Rep 2022;16:4.