|
单个神经元内部的信息传递主要通过电信号完成，神经元之间的沟通交流主要通过化学信号，即神经递质进行交流。这些神经递质可以与接收神经元上的膜受体结合，并激活信号传导途径，以改变神经元的活动。大多数膜受体是G蛋白偶联受体（GPCRs）。大脑常见的神经递质，如多巴胺和血清素，均与GPCRs结合，调节神经元活动。
在传统的改变神经元功能的方法中，科学家们使用针对GPCRs和其他膜蛋白的药物。通过激活或沉默特定的受体，研究人员可以调节神经元的活动，以了解大脑如何运作。然而，用于靶向受体的药物通常是非特异性的，会影响一个以上GPCR的活性。此外，相同的GPCR通常存在于多个组织中，这意味着即使是一种精致的特异性药物也可以激活整个大脑和身体的GPCR。 为了克服这个问题，Roth实验室对GPCR进行了工程设计，使它们只对特定的生物惰性化学物质（一种设计药物）产生反应。我们将这些经过修饰的GPCRs称为设计药物专一激活的受体（Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs，DREADD）。无DREADD的神经元对设计药物无反应，而表达DREADD的细胞对低浓度的设计分子反应强烈。
病毒部件解读 比如 rAAV-CaMKIIa-DIO-hM4D(Gi)-mCheery 病毒载体 rAAV: Recombinant adeno-associated virus, 重组腺相关病毒。以重组腺相关病毒为载体，即利用该病毒携带目的基因整合到宿主细胞中表达。神经科学中病毒的使用非常广泛，除了作为载体，还可以用于示踪神经元。我们前面一期讲到了利用狂犬病毒逆行示踪神经环路。关于病毒示踪技术，我们后期详细比较。 特异性启动子 CaMKIIα：Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II，兴奋性神经元启动子，即谷氨酸能神经元特异性启动子。 hSyn：human Synapsin I，成熟神经元特异性启动子。该启动子在不同类型的成熟神经元中均可发挥作用。
CD68：小胶质细胞特异性启动子 荧光蛋白 mCherry：单体红色荧光蛋白（mRFPs）mFruits家族的成员。作为一种RFP，mCherry来源于碟形海葵的DsRed，不像绿色荧光蛋白(GFP)通常来源于Aequoera victoria水母，荧光蛋白用于标记细胞中的成分，因此可以使用荧光光谱和荧光显微镜进行研究。mCherry在540-590nm之间吸收光，在550-650nm范围内发射光。通过将这些荧光蛋白标签精确地插入到许多不同生物的遗传物质中，基因组编辑得到了极大的改善。不同荧光蛋白的亮度和光稳定性的比较大多是在体外进行的，脱离了细胞或生物体内影响蛋白性能的生物变量，体外很难完美模拟细胞环境，环境的不同可能对亮度和光稳定性产生影响。 EGFP: Enhanced Green Fluorescent Protein 即增强绿色荧光蛋白，EGFP是GFP突变系。应用较多的是 GFP的突变体：增强型绿色荧光蛋 白(EGFP )( 64位苯丙一亮) ，发射出的荧光强度比GFP大 6 倍以上，因此，比GFP更适合作为 一种报告基因来研究基因表达、 调控、 细胞分化及蛋白质在生物体内定位和转运等。 化学遗传特异性受体 hM4D(Gi) 或者叫hM4Di：hM4D(Gi)是从人毒蕈碱乙酰胆碱受体M4 上改造的仅对CNO（clozapine-N-oxide）有反应的人工受体（designer receptors exclusivelyactivated by designer drugs，DREADD），不再受乙酰胆碱激活。在一些神经元里，CNO 结合hM4D 后，激活Gi 蛋白偶联的内向钾离子通道GIRK，使得细胞膜超极化，抑制神经元细胞动作电位发放。在不表达GIRK 或是Gi 的细胞中,hM4D 的功能会有所不同。
hM3D(Gq) 或者叫hM3Dq。hM3Dq是人M3毒蕈碱（hM3）受体的一种修饰形式，可被氯氮平（CNO）激活，参与Gq信号通路。Gq信号可释放细胞内储存的钙，增强神经元的兴奋性。因此，表达hM3Dq的神经元经CNO处理后，其发放频率（firing rate）急剧增加。
关于Gq Gs, Gi。Gq和Gs是激活性受体，而Gi是抑制性受体。Gq激活磷脂酶C（PLC）途径，Gs激活cAMP，随后激活蛋白激酶C（PKC）途径。这些都是G蛋白偶联蛋白受体信号通路的一部分。化学遗传就是利用上述原理来操纵神经元的激活和抑制。 光遗传通道蛋白 ChR2(H134R)：ChR2的突变体，将第134个氨基酸由组胺酸突变为精胺酸，该蛋白质可以产生两倍的光电流，但通道开关速度也比野生的ChR2慢了一倍。该突变体是运用最广的一种类型； NpHR：即为Halorhodopsin，第一个有效抑制神经元活动的光遗传学工具，在黄绿激光照射下会将氯离子打进神经元内，而抑制神经元活动。当把NpHR表达在哺乳动物脑内时，会聚集在内质网上，而如果将内质网输出元件加在NpHR基因序列后面，这样可以使得NpHR在胞内高量表达，而且不会聚集在内质网上，这样修改过的NpHR被称为eNpHR2.0。但是eNpHR2.0在细胞膜的聚集仍然不够，而将一个高尔基体输出元件和来自于钾离子通道Kir2.1的上膜元件加在eNpHR2.0基因序列后面，这样就能实现在神经元细胞膜上的高量聚集，这样修改过的NpHR被称为eNpHR3.0；
其他 IRES, 内部核糖体进入位点(Internal ribosome entry site): 一个长约数百碱基的基因工程原件。IRES能引导核糖体进入该序列，翻译3'方向的开放阅读框（ORF）。将IRES序列插入同一转录本下的两个开放阅读框中间，可以使一个转录本转译产生两个独立的蛋白质。如果需要令两个蛋白分开表达（例如需要一个蛋白进入细胞核中、另一个蛋白在细胞质中表达），又希望只在载体上构建一个转录本，那么可以选择在两个蛋白的编码区（CDS）中间加入一个IRES序列。 DIO：Double-floxed inverse Orientation, 是和Cre重组酶配合控制目的基因表达的元件。如果没有Cre重组酶的话目的基因不表达，在有Cre 的情况下目的基因才能开始表达 Ai14/Cre 或者叫 Cre::Ai14 : Ai14是一个Cre报告等位基因，设计有一个loxP侧翼的STOP盒，防止CAG启动子驱动的红色荧光蛋白变体(tdTomato)的转录。Ai14小鼠在Cre介导的重组后表达稳定的tdTomato红色荧光。Ai14可能在暴露于Cre重组酶之前表现出低水平的tdTomato表达，但Cre重组后的tdTomato表达水平明显大于这些基线水平。因此，建议研究人员在实验中加入Cre阴性对照，以建立基线tdTomato水平。 更多生物医学、神经科学问题关注公众号“时光医事” 参考：[1]https:///pub/dreadds [2]https://www./articles/s41386-018-0291-6 |
|
|
