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北京时间2022年4月21日晚23时，美国国立卫生研究院Hong Xu（徐洪）课题组在Nature Cell Biology杂志在线发表题为“The PPR domain of mitochondrial RNA polymerase is an exoribonuclease required for mtDNA replication in Drosophila melanogaster”的论文。 该研究首次证明果蝇线粒体RNA聚合酶是线粒体DNA复制的引物酶，并揭示了其合成复制起始所必需的RNA引物的分子机制。Hong Xu课题组的刘艺博士为文章的第一作者，Hong Xu研究员为通讯作者。  线粒体是细胞内较独特的细胞器，因为它们具有独立于细胞核DNA的遗传物质——线粒体DNA。与此同时，线粒体也是细胞内物质代谢与能量代谢中心，被称为细胞的“能量工厂”。线粒体功能缺陷被认为是导致多种包括代谢性及退行性疾病、心血管疾病、衰老和癌症的重要因素 。线粒体DNA（mtDNA，mitochondrial DNA）呈双链环状，共编码37个基因，其中包括13种电子传递链酶复合物亚基、22种tRNA和2种rRNA。mtDNA的完整性是维持细胞乃至机体正常功能的基本要求。迄今为止，尽管人们对线粒体的结构和功能已经有了比较全面的认识，但是对于mtDNA复制和转录等过程的了解还比较有限。mtDNA由 DNA聚合酶γ复制。然而，在mtDNA复制的起始阶段，合成单链RNA引物的引物酶仍不清楚。
分子生物学的“中心法则”解释了生物系统内遗传信息的流动。生物体以DNA的形式存储遗传信息，以RNA的形式携带遗传信息，最后将遗传信息转化为执行细胞功能的蛋白质。从基因到蛋白质的旅程在每个细胞内都受到严格且精准的控制，而这种准确性在线粒体DNA复制、转录和翻译的背景下尤为重要。近年来，越来越多的研究主要围绕mtDNA复制如何高保真及修复，还没有文献报道mtDNA转录过程是否存在校对，可能还有未知的机制有待发现。
在最新的这项工作中，作者在果蝇中创建了线粒体RNA聚合酶 (PolrMT) 基因敲除突变体。在缺失PolrMT的果蝇幼虫中，利用胸苷类似物EdU原位标记mtDNA的合成，发现PolrMT基因敲除突变体无法复制mtDNA（图1）。此外，作者利用大肠杆菌体系表达并纯化PolrMT，在M13噬菌体基因组DNA作为模板的体外转录实验中，相较于T7 RNA聚合酶，PolrMT不仅可以产生长度超过1,000个核苷酸的长链RNA，还能形成长度小于100个核苷酸的短链RNA。因此，PolrMT具备为mtDNA复制提供RNA引物的条件。  图1: PolrMT对mtDNA的复制必不可少 为了深入揭示PolrMT如何在mtDNA复制过程中发挥作用，作者通过体外表达及纯化一系列截短突变蛋白进行体外转录分析发现，果蝇PolrMT的PPR结构域对其合成短链RNA并起始mtDNA的复制不可或缺。进一步研究发现，PPR结构域具有核糖核酸外切酶活性（图2）。在以DNA-RNA杂合双链为底物反应时，PPR结构域可以特异性地降解RNA链直至保留最后5个核糖核苷酸，而这长度为5个核苷酸的短链RNA恰好成为启动mtDNA复制的引物。  图2: PPR结构域是3’-5’核糖核酸外切酶 通过系统的定点突变设计，作者成功筛选出单一位点突变蛋白PolrMTE423P，该突变蛋白不再具有核糖核酸外切酶活性，但保留PolrMT的转录活性。在果蝇成虫时期过表达PolrMTE423P蛋白，会导致果蝇出现早衰表型，其中包括行动力下降，对机械应力易感和寿命缩短等。在体外利用错配的 DNA-RNA杂合双链为底物，作者发现野生型的PolrMT依赖PPR结构域的核糖核酸外切酶活性，可以有效且快速的移除错误配对的RNA碱基。通过对线粒体转录组的高通量测序及分析，作者证实过表达PolrMTE423P蛋白并不影响正常的mtDNA转录和加工过程，然而，线粒体转录本的错配率却显著提高（图3）。以上结果首次阐释PolrMT在线粒体转录过程中可能的校对机制。  图3: PolrMT对mtDNA转录有校对功能 mtDNA的复制和转录对细胞的能量代谢至关重要。该研究首次揭示了果蝇PolrMT合成mtDNA复制必需的RNA引物的分子机制，为深入理解线粒体DNA的复制机制奠定了坚实基础。此外，该研究首次发现并阐释了果蝇PolrMT通过具有核糖核酸外切酶活性的亚基PPR结构域，进行剪切化学反应以校对mtDNA的转录。综上研究成果拓宽了人们对线粒体DNA复制及转录过程的认知，为理解和发展线粒体疾病治疗带来了重要启示。
编辑 | 余 荷 |
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