 引言 题目：Development of stable transgenic maize plants tolerant for drought by manipulating ABA signaling through Agrobacterium-mediated transformation 期刊名：Journal of Genetic Engineering and Biotechnology 单位：Nuziveedu Seeds Limited（印度第一大种子公司） DOI: https:///10.1186/s43141-021-00195-2 小编寄语：虽然文章影响因子不高，但是其中的玉米转化方法可以借鉴。  01 背景 非生物胁迫，特别是在开花期，会对植物的产量产生巨大影响。森林砍伐和城市化使地下水位非常低，并改变了气候，导致了不合时宜的降雨，并通过干旱和涝灾（非生物胁迫）等压力影响了作物的产量。通过育种培育耐胁迫植物是一项耗时的计划，并且在下表现不佳。通过转基因技术开发抗逆植物是较好的解决方案。玉米是主要的粮食和饲料作物，并且在乙醇生产中具有商业价值。两个在脱落酸途径和 ABA 信号传导的上游组分中起关键作用基因，nced (9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase) 和rpk (receptor-like protein kinase)，通过农杆菌介导的转化，获得很大的转化效率。 02 材料与方法 1. 植物材料：商业玉米品系NM74C 和 NM5884； 2. 农杆菌菌株和载体：EHA105农杆菌和载体pMDC99，分别由Lea (Lea P) 和SalT (SalT) 启动子驱动rpk和nced。这两个基因都被胭脂碱合酶（nos）终止子终止。潮霉素磷酸转移酶基因（hpt II）用作植物选择标记（图1）
图1. 用于农杆菌介导的玉米 ( Zea mays L.)转化实验的载体的 T-DNA 组成。 3. 外植体： 植物授粉 (DAP) 后 12 至 15 天收获的未成熟穗用 10% 次氯酸钠溶液 (4% w/v) 消毒 15 分钟，然后用无菌蒸馏水洗涤 3 次，每次 5 分钟. 解剖幼粒以分离胚胎；其中 2 毫米大小的 IE 仅用作外植体（图2）。
图2. 玉米培养的不同阶段，从接种的新生外植体（未成熟胚）（A ）到完全发育的硬化植物，经过不同阶段的农杆菌介导的转化，即共培养（B )、选择 I ( D )、选择 II ( F )、植株再生 ( H ) 和植株生根 ( I )；没有共培养的培养物在每个阶段都充当对照（C，E和G） 4. 外植体感染与共培养 从农杆菌培养板中挑取的单个菌落接种于 Luria Bertani 肉汤 (LB) 液体培养物中，该液体培养物中添加了利福平和氯霉素各 25 mg/L 的浓度和 50 mg/L 的卡那霉素，并在 28 °C 下通过在200 rpm 过夜，直到达到 0.8 光密度 (OD)。然后将其（悬浮液）以 6000 rpm 离心 20 分钟，将沉淀溶解在等体积的感染培养基中，然后用于感染外植体（IE）或愈伤组织。 5. 愈伤组织诱导和再生 补充有浓度 1.5 mg/L的 2, 4-二氯苯氧乙酸的 LS培养基用于参与转化的所有步骤即感染、共培养，选择（再生除外），在我们之前的研究中发现是最好的浓度[1]。补充有 6-苄基氨基嘌呤 (BAP) 和激素的 LS 培养基分别以 0.5 mg/L 的浓度作为再生培养基。 6. 转基因的表征 PCR、Southern blot、生理生化指标（离子渗漏、脂质过氧化、脯氨酸和叶绿素、类胡萝卜素测定） 7. 干旱筛选的转基因玉米盆栽试验 用三个独立的转基因植物与野生型在严重缺水条件下（9天）进行盆栽试验，然后采集叶片样品用于 ABA 分析。9天后，通过向所有植物平均浇水用来使植物恢复正常。 8. 激素 (ABA) 提取和分析 高效液相色谱 (HPLC) 系统进行激素定量分析。 03 主要结果 1. 遗传转化方法： 对于遗传转化，首先对外植体进行农杆菌感染（图2A ），发现这不仅对愈伤组织的生长和愈伤组织的存活率而且对植物的再生都没有效果。大多数胚胎没有产生任何愈伤组织并变成棕色；只有少数胚胎诱导初级愈伤组织，但在两种基因型中均未从中产生小植株；因此，在接种后的不同时间间隔，即10、20、30 和 40 天后，具有起始愈伤组织的 IE 被用于共培养。从外植体中增殖的愈伤组织被传代培养到补充有激素和头孢噻肟（500 mg/L）而没有抗生素（潮霉素）的培养基上。2周后，将愈伤组织转移至选择培养基I，然后转移至选择培养基II（添加1.5mg/L 2、4-D分别具有10和12mg/L潮霉素的LS培养基），间隔2周。在选择培养基 II 上存活的转化愈伤组织已转移到再生培养基上。在选择阶段和再生阶段都研究了愈伤组织的存活频率（表1）。在整个实验过程中，未与农杆菌共培养的 IE作为对照（图2 ）C、E、G)。在这些基因型中，选择培养基 II 上的存活频率范围为 1% 至 46%，再生频率范围为 1% 至 25%。在 20 天后进行感染的 NM5884 自交系中发现最大存活和再生频率为 46 和 25，在 NM74C 自交系中观察到最低存活 (1%) 和再生 (1%) 频率。在外植体接种后 20 天进行共培养，导致愈伤组织在继代培养以及两个选择阶段的最大存活率（表1）（图2 B、D、F）。还发现再生频率在两个近交系中都最大。愈伤组织生长（继代培养，选择 I 和 II）的存活频率以及再生频率随着共同培养时间间隔的增加而增加，最多 20 天，然后随着时间的进一步增加而降低行。在所使用的两个自交系中，在所有时间间隔内，NM5884 的愈伤组织存活率和再生频率均高于其他自交系 NM74C。发现这两个自交系之间的差异对于存活频率和再生频率是显着的 (ANOVA) ( p = 0.05)。但是，这两个参数在任何近交系（组变异内）中均未发现显着（p < 0.05）。 2. 生理生化表征： 在体外进行的所有实验中，显示转基因生物化学活性水平高于的对照植物。由于大多数症状与膜损伤有关，因此已在转基因植物和对照植物的受压和未受压叶盘生长的培养基中进行了作为电导率 (EC) 函数的实验。在有应力和无应力控制之间观察到离子泄漏随电导率的显着增加；另一方面，没有观察到任何转基因之间的显着差异（图4）。
图4. 通过研究正常条件下（未受胁迫）和用甲基紫精模拟胁迫后的电导率，通过离子泄漏研究在农杆菌介导的转化后再生的假定转基因玉米植物 (Trg1-3)及其相应的未转化对照植物的生理特征。 通过测量受胁迫和未受胁迫的对照和转基因植物中的 MDA（丙二醛）水平，还通过脂质过氧化对膜损伤进行了生化研究（图5）。发现对照中的MDA含量在胁迫条件下增加，而在转基因植株中，观察到MDA反应物质在胁迫下减少（图5）。脯氨酸积累研究表明，尽管对照和转基因植物在胁迫下比在正常（非胁迫）条件下相应的反植物积累更多的脯氨酸，但转基因植物中脯氨酸的积累明显多于对照植物。在转基因中，Trg-2（ET-5）积累了更多的脯氨酸（图5）。光合色素叶绿素A、叶绿素B、总叶绿素和类胡萝卜素的分析表明，除类胡萝卜素外，在转基因胁迫条件下，叶绿素A、叶绿素B和总叶绿素均减少或保持不变。与正常（非胁迫）条件相比，在对照植物中，胁迫条件下色素含量的减少更多。另一方面，在所有转基因中发现类胡萝卜素含量没有变化或略有增加；而在非转基因中，发现色素含量没有变化或略有下降（图5）。
图5. 通过脂质过氧化、脯氨酸、叶绿素-A、叶绿素-B、总叶绿素，研究在农杆菌介导的转化及其相应的未转化对照植物后再生的假定转基因玉米植物 (Trg1-3) 的生理和生化特征。 3. 干旱筛选的转基因玉米盆栽试验 在严重缺水条件下对三种独立的转基因植物与野生型对照进行盆栽试验。9天后，通过向所有植物平均浇水来恢复植物。收集叶样品并进行 ABA 酶测定。使用 HPLC 方法测量 ABA 含量。结果如图7所示，与非胁迫条件下相比，发现所有转基因植物在胁迫条件下的 ABA 含量增加，而对照植物在胁迫条件下显示出 ABA 含量降低（图7）。在盆栽实验（体内）中暴露于干旱的转基因植物显示出比对照植物显着优越的存活能力。将它们放置 14 天，其中处于胁迫（无水）下的对照植物完全干燥，转基因植物保持绿色（图8）。
图7. 农杆菌介导的转化后再生的假定转基因玉米植物 (Trg1-3)及其相应的未转化对照植物通过 ABA 酶测定在正常条件下（未胁迫）和胁迫后的生化表征
图8. 野生型和转基因品系 (Trg-2) 在有水 ( A ) 和 14 天无水条件下 ( B )的情况 04 讨论 在农杆菌介导的转化过程中，每一步都对所使用的基因型和外植体至关重要且具有特异性；因此，通过改变每个参数，在预选择和选择阶段以及再生阶段研究了生长和再生效率。对于某些基因型，在感染前外植体的预培养是必要的，其中外植体在没有预培养的情况下没有反应。在本研究中，外植体培养较长时间（20 天）在诱导愈伤组织后具有积极的反应。 大多数参与干旱胁迫耐受性的基因将受到 ABA 途径的影响，因此，ABA 途径中的基因或改变该途径的其他基因将影响干旱耐受性。在脱水胁迫盆栽实验中，非转基因对照植物在长时间受到胁迫后表现出萎蔫和完全干燥，而转基因品系没有任何萎蔫。通过考虑体外和体内研究一起，nced和rpk这两个基因的过度表达导致了良好的应激稳定性并积极增加了耐受性。 05 参考文献 [1] Sridevi M, Pavan Kumar G, Sreenu P, Kodandarami Reddy M, Sateesh Kumar P, Premalatha D (2020) Distinctive response of maize (Zea mays L.) genotypes in vitro with the acceleration of phytohormones. J Plant Biotechnol 47(1):26–39. https:///10.5010/JPB.2020.47.1.026 06 获取原文 https://www./h-nd-43.html#_np=107_423 页面底部点击“附件下载”即可获取原文。 |
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