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污染：在组织培养过程中，由于真菌、细菌等微生物的浸染，在培养容器内滋生大量的菌斑，使培养材料不能正常生长和发育的现象。在组织培养中污染是经常发生的，造成污染的原因也很多，主要有： 1、培养基及各种使用器具消毒不彻底。 2、外植体灭菌时不彻底，有菌残存在细胞中。 3、操作时人为因素带入。 4、环境不清洁。 5、超净工作区域污染。 污染的特征 1 在组织培养实验室中，污染的病原分为细菌和真菌两大类。 细菌污染的主要特征是：在培养过程中，培养基或外植体上出现黏液状或水迹状物，有时需要仔细辨认才能看清。这种症状表明，所受的污染可能是细菌污染，在接种1～2d即可发现。 细菌污染主要是由于培养基灭菌不够彻底，材料带菌或在接种操作时没有对外植体进行彻底灭菌所致。主要是工作人员使用了未经充分灭菌的工具(镊子、培养皿等)及呼吸时呼出的细菌所引起的。也可能是手接触材料或器皿边缘，使微生物落入材料或器皿，要求操作人员严格按照无菌操作程序操作。 真菌污染的识别方法：接种后培养基或外植体表面出现白、黑、绿等色的块状真菌孢子，其蔓延速度较快，在接种3～10d后可发现。真菌污染比较容易通过空气、培养容器、瓶口进行污染，因此要加强对空气的灭菌管理，在每次操作前，最好先用紫外线灯灭菌20～30min，再用75％的酒精对容器材料表面进行喷雾灭菌。此外，外植体的褐变有时也是造成培养基或被培养物污染的原因之一。 污染的预防措施 2 2.1 要定期对接种环境进行熏蒸消毒，所有器具均需进行高温灭菌后才能使用。 2.2 定期对超净工作台的初过滤器进行清洗和更换。在使用超净台前开启通风装置并打开紫外灯灭菌20min，操作前用75％酒精擦拭整个操作台面； 2.3 接种前，工作人员必须彻底地洗手，并用70％酒精棉球擦拭双手。在每次接一两瓶材料后，最好再用酒精擦一下手指，接种用的镊子和解剖刀或接种针也要经常在酒精灯的火焰上烧灼灭菌(必须冷却后才能用于接种材料)。 2.4 材料接种好以后，将瓶口置于火焰上转动，使瓶口各部分都烧到，目的是固定或杀死留在瓶口上的细菌及避免灰尘污染瓶口。建议不要在超净工作台里使用酒精灯等灯具，因为这样热的火焰会引起空气对流而破坏超净台里本来规则的空气层流，使本来存在于超净台底层的微粒被带到上层，带来更多的污染机会。 2.5 在用茎尖作外植体时，可在室内或无菌条件下对枝条进行预培养。将枝条用水冲洗干净后插入无糖的营养液或自来水中，使其抽枝，然后以这种新抽的嫩枝条作为外植体，可大大减少材料的污染。或在无菌条件下对采自户外的枝条进行暗培养．待抽出较长的新生枝条时再采取枝条，也可明显减少污染。此外，避免阴雨天在户外采取外植体。在晴天采材料时，下午采取的外植体要比早晨采的污染少，因材料经过日晒后可杀死部分细菌或真菌。 2.6 由于植物组织培养材料只能进行表面灭菌，表面消毒并不能除掉所有的病菌，有些病菌可以侵入材料内部，尤其是木本植物，材料内部易感染病菌，因而必须在培养基中加入抗生素类药品来有效控制这类污染。但应注意抗生素对某些种类的植物生长有抑制作用，至于植物该使用哪一类抗生素，用多大浓度才适宜，要在实践中去摸索。如彩色马蹄莲在组织培养时，培养基中添加了不同种类不同浓度的抗生素，发现50mg/L硫酸链霉素抑菌效果最好。芦笋组培苗继代时，采用四种抗生素处理来防治细菌污染，多种抗生素都能抑制细菌的污染，其中以卡那霉素抑制效果最好。 2.7 所用的培养基一定要在培养室中预培养2～3d。然后再进行检验，确定无细菌感染的迹象后才能使用。 2.8 为了防止因接种而造成细菌，应对初代培养、继代培养的繁殖材料进行系统地检查，发现有被细菌污染的迹象时，应该将其清除。 常见问题 3 Q1：灭完菌，凝固好的培养基上面会有一层水是什么原因？如果将植物材料转接于这样的培养基中，会有什么后果？ 培养基灭过菌后或多或少会有积水现象，一般来说冬天要轻一些。如果积水太多接种的时候倒出来，不然容易造成容器壁水珠比较多，影响光照，从而造成玻璃化现象加重。 Q2：培养基中加洋葱的作用 培养基中添加有机附加物，如马铃薯、香蕉、椰汁等，主要是由于他们含有丰富的糖、蛋白质、各种无机盐、维生素以及各种活性物质。洋葱也不例外，除了含有丰富的营养物质之外，洋葱还含有丰富的硫化合物，是强有力的抗菌成分，能杀死多种细菌。 Q3：高压灭菌后培养基的pH会变大还是变小？MS和1/2MS哪种培养基pH变化更大？ 培养基灭菌后pH会降低0.2左右，其主要原因就是有机物的分解，特别是维生素、氨基酸和糖，因此MS会比1/2MS培养基pH变化更大。 Q4：内生菌造成的污染在外观上怎么辨别？ 内生菌是指在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官的细胞间隙或细胞内的细菌，可通过组织学方法或从严格表面消毒的植物组织中分离或从植物组织内直接产生扩增出微生物DNA的方法来证明其内生。在植物组织培养中，由于材料内部的内生细菌不能被一般的表面消毒方法所清除，随着材料带入培养过程，从而引起的污染称为内生细菌污染。从污染状态来看，是发生于植物材料周围，一般会由培养基内向外延展，并且发生的时间也会比接触性污染要长，接触性的细菌一般在2－4天表现，内生菌则会超过4天，并且菌的种类也相对单一。
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