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图 高彩霞和她的团队的一名成员在北京种植设施的温室中检查CRISPR转基因番茄植物 https://www./articles/d41586-022-01117-z 作者：Michael Eisenstein 有什么比一颗完美甜美的夏季草莓更好的吗？唉，许多商业浆果看起来比尝起来更好。但是北京遗传与发育生物学研究所的分子生物学家高彩霞和她的同事们发明了一种方法，通过一些简单的基因调整来调节草莓的甜味。“我们可以将总糖含量从每克20毫克增加到41毫克，”她说。"有这么多不同的级别，你可以选择你喜欢的." 越来越多的研究小组转向所谓的基础编辑和主要编辑策略，以提高商业谷物、水果和蔬菜的产量、稳健性和消费者吸引力，高就是其中之一。这些方法是对广泛使用的CRISPR–cas9系统的改编，该系统可用于在DNA中指定的位置引入特定的变化。例如，它们允许科学家调整感兴趣的蛋白质的氨基酸序列，或者改变控制基因表达强度的序列。 生物医学研究人员已经将这些技术作为工具，用于研究和潜在修复与各种遗传疾病相关的突变。相比之下，更甜的草莓可能看起来像小土豆，但同样的能力正被用来培育抗病能力更强、营养含量更高或单株果实更多的作物。 至关重要的是，这些编辑系统有朝一日可能会提供一种有吸引力的替代方案，取代添加其他物种的基因来生成转基因生物(GMOs)，后者仍是公众怀疑和密切监管审查的对象。“转基因生物有其他来源的基因，但对于基因编辑植物，你可以让这些植物没有任何外来基因——只是植物自身基因的一些小变化，”中国上海植物胁迫生物学中心主任朱健康说。第一批经过基础编辑的水果、蔬菜和谷物可能在未来几年内到达消费者手中，但在朱和其他植物科学家能够常规生产定制作物以满足饥饿星球的需求之前，仍有许多工作要做。
碱基编辑 在CRISPR编辑中，一种被称为Cas9的酶被导向基因组中的一个特定位点，在那里它结合并剪切两条DNA链。靶向是通过指导RNA实现的，它在DNA中寻找匹配的序列。 在Cas9切割DNA后，细胞通过一种称为非同源末端连接的机制修复损伤。这种修复过程通常导致在切割位点插入或缺失随机碱基对，从而破坏靶基因的功能。马里兰大学帕克分校的植物科学家依平·齐说:“这种方法很有效，但并不精确。”。“因此，这很容易导致基因敲除，但不一定是你希望实现的结果。”如果目标是优化基因的功能，而不是简单地阻止它的发展，那么这种缺乏可预测性就成了一个特别的问题。 有突变？碱基编辑一次固定一个核苷酸基因组 2016年，马萨诸塞州剑桥市哈佛大学的化学生物学家刘中达的团队开发了一种解决方案。研究人员将Cas9的修饰版本融合到一种叫做胞苷脱氨酶的酶上，这种酶以化学方式修饰胞苷碱基，使C–G碱基对转化为T–A——这一过程称为胞嘧啶碱基编辑。
DAVID LIU（刘如谦）团队开发了一种腺嘌呤碱基编辑器，在第二年将A–T碱基对转换为C–G碱基对3，此后又设计了数十种其他的胞嘧啶和腺嘌呤碱基编辑器。这项技术已经非常好地从哺乳动物细胞转化为植物细胞，只需要适度的修改来优化该技术的效率和特异性。根据基因靶标和植物种类，效率变化很大，但可高达100%。 2019年，法国的研究人员使用胞嘧啶碱基编辑器在一种名为eIF4E1的基因中创建了一个单核苷酸变化，该基因编码一种蛋白质，该蛋白质有助于将RNA翻译成蛋白质4。参与这项工作的凡尔赛法国国家农业、食品和环境研究所(INRAE)的植物遗传学家杨奇煜·诺古说:“这种蛋白质也被一些病毒用于它们自己的复制周期。”。一次编辑足以使拟南芥对三叶草黄脉病毒(一种常见的植物病原体)基本免疫。 那一年，高的团队利用碱基编辑在小麦基因组的两个位点引入点突变，赋予小麦对多种除草剂的抗性。 研究人员甚至可以进行“定向进化”实验，将随机突变引入各种基因，以识别改善特定植物性状的新变异。例如，2020年，高和她的同事们利用胞嘧啶和腺嘌呤碱基编辑系统改造了一种水稻基因的变异体，使其对一种叫做乙酰辅酶a羧化酶抑制剂的除草剂产生抗性。“靶向域是400个氨基酸，我们设计了200个完全覆盖这个域的指导RNA，”高说。"然后，我们通过喷洒除草剂来筛选突变体，以观察哪些新的变异体存活下来."这项工作揭示了赋予抗性而不会对植物健康产生不利影响的突变。 绝好的机会 尽管基础编辑功能强大，但潜力有限。12个可能的碱基对变化中只有4个可以可靠地实现。研究人员已经开发了一些胞嘧啶-鸟嘌呤碱基编辑器，但齐的团队去年完成的一项评估发现这些通常是不充分的7。齐形容他们“效率不高”，并表示“在如何使其更好方面仍存在知识差距”。 碱基编辑也不适合在基因中进行大范围的改变，例如长的插入或缺失。这些类型的修饰可以通过传统的CRISPR–cas9利用一种称为同源定向修复的过程来实现。这里，细胞在Cas9切割位点掺入了含有所需序列变化的供体DNA链。但是这一过程在工厂中仍然效率低下。德国卡尔斯鲁厄理工学院的植物生物化学家霍尔格·普赫塔说:“也许在最好的情况下，你可能会获得5%的效率。”。
一名研究人员从培养皿中取出CRISPR转基因小麦幼苗，种植在土壤盆中 CRISPR转基因小麦种植在北京一个种植设施的温室中。 作为一种替代方案，刘研究团队在2019年描述了另一种基于CRISPR的策略，称为prime editing8。像碱基编辑一样，引物编辑使用修饰的Cas9蛋白进行单链切割。但这一次，Cas9与逆转录酶相连，而不是核苷酸修饰酶。引物编辑还使用了一种特别设计的引物编辑指导RNA (pegRNA)，它不仅可以将编辑机器靶向基因组中的特定位点，还包含模板序列和引物结合序列。模板编码所需的基因组序列变化。并且在DNA被切割后，引物结合序列与切割位点处的DNA杂交，为逆转录酶将RNA模板转化为DNA提供立足点，从而将编码序列写入基因组。这个过程可以改变任何核苷酸，也可以插入或删除几十个碱基长的序列。 由此产生的多功能性为复杂、强大的编辑打开了大门。Nogué指出，单碱基编辑在抵御植物病原体方面只能做这么多。“你的改造越简单，病毒就越容易逃脱，”他说。他的团队与阿维尼翁INRAE的合作者一起，检查了对马铃薯y病毒的抗性的自然发生的决定因素，马铃薯y病毒可以严重损害植物，并确定了eIF4E1基因中的五种氨基酸变异体，这些变异体共同保护豌豆植物免受感染4。Nogué现在正在使用prime编辑将这种保护转移到土豆上。“随着多种氨基酸的变化，我们认为我们将带来持久的耐药性，”他说。 超级精确的新CRISPR工具可以解决过多的遗传疾病 1对PubPeer的评论(作者:Sandeep Chakraborty) 最初的prime编辑器效率相对较低，通常与同源定向修复所能达到的水平相当。但是一些基因组序列似乎比其他的更容易处理，一个设计良好的引物编辑实验可以使效率翻倍。“我认为仍有改进的空间，”高说，他的团队已经设计了多种策略来提升prime编辑的性能，包括复杂的pegRNA设计和基于Cas9的编辑复合体的变体，这些变体具有增强的功能。 就他们而言，Nogué和他的团队已经在充分表征的模式植物物种中发现了主要编辑的成功。他说，某些改进“使这项技术和我们手中的基本编辑一样有效”。“如果我们在模型植物中观察到的对农作物来说是真的，那么我认为这个工具将会非常非常有用。” 种瓜得瓜，种豆得豆 对于一些经过充分研究的作物，应用基本编辑或主要编辑相当简单。朱的团队在水稻和其他主要作物如小麦、玉米、西红柿和土豆上广泛使用了这两种技术，并证明了它们也可以进行编辑。齐指出，有几个基于网络的工具可以帮助研究人员选择适合他们的编辑系统，包括PlantPegDesigner，一个由高团队设计的应用程序10。 但是这一过程的重要部分仍然是一场斗争。第一个是转化，研究人员将编辑机制引入植物细胞的过程。最常见的转化策略之一是使用土壤细菌根癌农杆菌感染并随后将编码Cas9蛋白和相关RNA的DNA质粒传递到植物细胞中。然而，这种DNA随后也整合到植物基因组中——鉴于该领域的重点是避免外源DNA的永久引入，这是一种不理想的结果。基因组编辑机制的长期表达也存在不必要的修改风险。 研究人员可以通过将编辑所需的材料输送到原生质体中来实现无外源DNA的转化，原生质体是培养的植物细胞，已经用酶剥离了它们的外壁。对于研究人员来说，这种细胞更容易瞬时转化，用DNA或RNA试剂编码编辑机器。“你正在制造只有细胞膜的细胞，就像人类细胞一样，”齐说，他指出，这一过程也为快速测试和优化碱基或引物编辑实验提供了一种强大的方法。另一种可能性是使用“基因枪”向胚胎植物细胞发射载有蛋白质和RNA的微小射弹。在这两种情况下，编辑机制只会在细胞中暂时活跃，然后才会被降解，这与DNA整合到宿主基因组中时发生的长期表达形成了对比。 无论是哪种转化方法，研究人员都必须使用编辑过的细胞来再生整个植物。但是对于许多植物物种来说，生物学家根本不具备分离、培养和瞬时转化适当细胞的知识或专业技能。“自然界中有37万多种高等植物物种，”朱说。“但我们只能在其中的几十个方面取得成功。”一些新兴的技术解决方案可能会有所帮助；例如，编码生长调节因子的基因的过表达可以大大提高基因编辑植物的再生效率11。“很可能我们会看到更多很难改造的植物因此被改造和编辑，”普赫塔说。 研究人员还受到对许多与植物生长、弹性和质量相关的关键性状的潜在生物学缺乏基本了解的阻碍。Nogué说:“如果没有基因组知识和对特定特征背后的机制的深入了解，这些类型的工具完全没有用。 基因组分析技术的成本下降和效率提高应该是一个福音，人们正在努力开始将临床遗传学中常用的一些技术应用到农业部门。例如，位于北卡罗来纳州达勒姆的生物技术公司Pairwise的首席技术官瑞安·拉普(Ryan Rapp)表示，该公司由刘(音)联合创立，并已获得其碱基编辑技术的许可，该公司正在与美国和加拿大的政府和学术科学家合作，以识别至少300种独特的浆果物种和品种的50多种性状的遗传基础。“通过这次合作，我们从几乎一无所有到拥有超过600个测序基因组。” 超越转基因生物 然而，即使只有他们目前拥有的工具，这个领域也在快速发展。拉普说，Pairwise的第一个基础编辑产品，一种营养成分增强的绿叶蔬菜，预计明年将进入美国市场。另一个成对的项目，无核樱桃，现在正在田间测试，但将需要更长的时间才能到达市场，因为樱桃树比成行种植的作物需要更长的时间来培育。 这样的产品，加上类似的项目，如高的更甜的草莓，可能正是帮助建立公众和监管机构的信任所需要的。包括美国农业部和中国农业部在内的一些监管机构给予了CRISPR编辑植物比转基因转基因生物更多的自由，只要这些生物不掺入外源DNA。其他司法管辖区更不情愿。但是，除非公众被说服，否则这项技术可能会胎死腹中。“我认为整个社区已经看到，如果你想让人们接受基因编辑作物或食品，你最好让它对公众更有吸引力，”齐说。 成功可以打开一些真正变革性应用的大门，包括抵御气候变化影响的未来全球农业。Puchta指出，通过移植单个基因来增强抗旱性或耐盐性的尝试只取得了有限的进展。但他看到了向另一个方向发展的巨大潜力:通过调整粗糙的野生作物的可食用性和农艺性能来驯化它们。 高已经证明了这个想法是可行的。2018年，她的团队及其合作者利用传统的CRISPR–cas 9，通过操纵与水果大小、产量和营养成分等性状相关的五个基因，驯化了一种南美野生番茄。“如果通过自然驯化，这个过程从头到尾需要8000年，”她说。“现在只需要一年半了。” Gao has already shown that the idea can work. In 2018, her team and its collaborators used conventional CRISPR–Cas9 to domesticate a wild South American tomato by manipulating five genes linked to traits such as fruit size, yield and nutrient content12. “Through natural domestication, this process takes 8,000 years from start to finish,” she says. “Now it’s one-and-a-half years.” Nature 604, 790-792 (2022) doi: https:///10.1038/d41586-022-01117-z 【免责声明】图文来自网络，版权属于原作者，如有侵权或非授权发布之嫌，请联系我们，我们将及时更正、删除。转载目的在于促进信息交流，并不代表本公众号赞同其观点或对其内容真实性负责。 |
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