 “我把论文按 Science 的格式改好后发给了我在斯坦福的博后导师 Mark，希望在宝宝出生前再投出去，但不料宝宝在预产期前两天出生了，出院两天后才终于提交论文。”这是清华大学博士黎静的一篇顶刊论文在投稿时的小“插曲”。不仅如此，正式发表在 Science 之前，她曾投稿其他三家顶刊均遭到拒绝。  图 | 黎静（来源：黎静） 她说：“虽然过程充满波折和考验，但我们的论文也在这个过程中不断完善。为了纪念这段难忘的经历，我将从补实验以来就在肚子里陪伴我一起战胜困难的宝宝取名为'Kiera’，与 KIR 发音相似。” KIR 的全称是 Killer cell Immunoglobulin-like Receptor，中文名为杀伤细胞免疫球蛋白样受体，是此论文聚焦的 CD8+ 调节性 T 细胞的表面标志物。 论文题为《KIR + CD 8 + T 细胞抑制致病性 T 细胞，并在自身免疫性疾病和 2019 年新型冠状病毒肺炎中激活》（KIR+CD8+ T cells suppress pathogenic T cells and are active in autoimmune diseases and COVID-19）。黎静在该论文中报道了对人体内具有调节功能的 CD8+T 细胞亚群的发现和鉴定。  图 | 相关论文（来源：Science） 审稿人表示：“作者在人体中发现并鉴定了一个全新的具有调节功能的 CD8+T 细胞亚群，并为它们在人体内的存在以及它们对致病性 CD4+T 细胞的抑制作用提供了充足的证据，KIR+CD8+T 细胞选择性抑制引发自身免疫反应的致病性 CD4+T 细胞、以及它们在多种自身免疫病中扩增等发现加深了我们对自身免疫力和病原体感染的免疫调控机制的理解，这些发现对自身免疫病、传染病甚至癌症靶向治疗的新药开发具有重要的意义。” CD8+ 调节性 T 细胞的研究历程  目前，人类自身免疫病多达八十几种，发病率占全球人口的 7.6%～9.4%，而且逐年上升，成为影响人类健康不容忽视的问题。当下，由于缺乏对这类疾病发病机制和调控机理的理解，对这类疾病的治疗局限于糖皮质激素等广泛抑制免疫反应的药物的使用，依然缺少真正有针对性的治疗手段。 一些病人被细菌或病毒感染后，血清中自身抗体的水平短暂升高，而部分自身免疫病病人发病前也有传染病病史，但传染病与自身免疫病之间的因果关系，以及人体如何在病原体感染过程中精确控制自身免疫反应、而不影响免疫系统对病原体的清除有待进一步研究。 自身免疫反应受多种免疫细胞调控，调节性 T 细胞（Treg）是其中一种。其中，CD4+Treg 于 1995 年被发现后一直是研究的热点，它们的来源以及免疫抑制机理也已研究得比较清楚：FOXP3 是决定 CD4+Treg 的细胞命运和维持其抑制功能的转录因子，CD4+Treg 通过分泌抗炎细胞因子以及下调抗原呈递细胞上的共刺激分子等方式来抑制免疫反应。目前，以 CD4+Treg 为靶点的免疫疗法已进入临床试验。 虽然早在 1992 年，麦德华教授和本韦努托·佩尼斯（Benvenuto Pernis）教授课题组就在小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE，Experimental Autoimmune Encephalomyelitis）中，发现了 CD8+T 细胞的免疫抑制功能[1, 2]，但对 CD8+T 细胞调节性功能的研究进程远比 CD4+Treg 曲折和漫长。 期间，哈佛大学 Dana-Farber 癌症研究所本韦努托·佩尼斯（Benvenuto Pernis） 团队为小鼠中 CD8+Treg 的研究作出了重要贡献，他们在 2010 年发现小鼠中具有免疫抑制功能的 CD8+T 细胞表达 Ly49 受体[3]，并通过识别滤泡辅助 T 细胞（Tfh）等靶细胞表面的非经典 I 类主要组织相容性复合体（MHC-I）Qa-1 来杀伤靶细胞并维持免疫耐受[4]。 2019 年，黎静所在的斯坦福大学医学院马克·戴维斯（Mark Davis）实验室的博士后纳雷莎·萨利格拉玛（Naresha Saligrama）发现，EAE 小鼠中正在克隆扩增的 CD8+T 细胞不识别 MOG 抗原，他用 H-2Db（经典 MHC-I）酵母展示技术筛选到这些 CD8+T 细胞识别的多肽，用这些多肽去免疫小鼠可以通过激活 EAE 小鼠中的 Ly49+CD8+T 细胞而抑制疾病进展 [5]，这说明 Ly49+CD8+T 细胞除了识别非经典 MHC-I 外还可识别经典 MHC-I。相比非经典 MHC-I，经典 MHC-I 的表达范围更广、表达水平更高，暗示 CD8+Treg 可能在维持免疫耐受中发挥更广泛的作用。 然而，由于人体内不存在 Ly49 同源蛋白，人体内是否存在类似的细胞这一问题一直悬而未决，因此虽然 CD8+T 细胞的调节功能已被发现多年，但一直没有开发出靶向 CD8+Treg 的疗法。 在该研究中，黎静和同事发现人体内 KIR+CD8+T 细胞与小鼠 Ly49+CD8+T 细胞，具有相似的表型和调节功能，它们上调于自身免疫病和传染病病人的外周血和受累器官，可选择性地杀伤乳糜泻病人外周血中识别麦醇溶蛋白抗原的致病性 CD4+T 细胞。 在传染病中，这类 CD8+Treg 可抑制由病毒感染引发的自身免疫炎症，同时不影响抗病毒免疫反应[6]。这些发现帮我们理清了自身免疫病和传染病之间的联系，加深了我们对维持外周免疫耐受的机制的理解，并且对未来开发靶向 CD8+Treg 的新型免疫疗法具有重要的指导意义。  （来源：Science） 投稿历时两年曾被三家顶刊拒稿，绝不放弃最终发在 Science  虽然人体内不表达 Ly49 同源蛋白，但 KIR 和 Ly49 家族蛋白一样，与其配体 MHC-I 分子共同进化，鉴于 KIR 和小鼠 Ly49 在功能上的相似性，而且 Ly49+CD8+T 细胞在 EAE 小鼠中增多，黎静首先分析了多发性硬化症（multiple sclerosis，MS）和系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）病人以及健康人外周血中表达抑制性 KIR 受体的 CD8+T 细胞，结果发现这些自身免疫病病人外周血中 KIR+CD8+T 细胞的比例高于健康人。  （来源：Science） 他们因此备受鼓舞，并继续分析更多的自身免疫病病人样本，并分选出 KIR+CD8+T 细胞进行多细胞和单细胞转录组和 T 细胞受体（T cell receptor，TCR）测序分析。 测序结果显示，KIR+CD8+T 细胞与小鼠 Ly49+CD8+T 细胞的基因表达高度相似，而且 KIR+CD8+T 细胞的克隆扩增水平高于 KIR-CD8+T 细胞。 虽然这些发现令人振奋，但更重要的是如何证明 KIR+CD8+T 细胞跟小鼠 Ly49+CD8+T 细胞一样具有抑制功能。EAE 小鼠中 Ly49+CD8+T 细胞通过穿孔素等细胞毒分子，来抑制 MOG 抗原特异的致病性 CD4+T 细胞，因此他们想到人类中乳糜泻疾病（Celiac disease，CeD）是唯一已知致病抗原的自身免疫病，来源于食用麸质的脱氨麦醇溶蛋白（Gliadin）会激活 CeD 病人体内的致病性 CD4+T 细胞而引发自身免疫反应（临床中该疾病的主要治疗方法是让病人坚持无麸质饮食）。 所以，他们可以用多肽-MHC 四聚体技术来检测那些识别 Gliadin 主要抗原表位的致病性 CD4+T 细胞并探究 KIR+CD8+T 细胞对它们的影响。于是，黎静等研究者从携带 HLA-DQ2.5 基因的 CeD 病人中收集外周血并分离外周血单核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs）。 为了进一步激活 KIR+CD8+T 细胞，他们通过流式分选分离出 KIR+ 和 KIR-CD8+T 细胞，并用 anti-CD3/CD28 磁珠刺激过夜，第二天再移除磁珠将 KIR+ 或 KIR-CD8+T 细胞加入到用脱氨麸质刺激的 PBMCs 中共培养 6 天。 这时他们发现，脱氨麸质可刺激 Gliadin 特异性 CD4+T 细胞的增殖，而 KIR+CD8+T 细胞的存在会大大减少 Gliadin 特异性 CD4+T 细胞的数量。  （来源：Science） 此后，黎静又通过一系列实验进一步阐明了 KIR+CD8+T 细胞对 Gliadin 特异的致病性 CD4+T 细胞的抑制机理：KIR+CD8+T 细胞通过 MHC-I 分子识别致病性 CD4+T 细胞，并利用其细胞毒活性诱导致病性 CD4+T 细胞的凋亡。 前面研究的 KIR+CD8+T 细胞都来自于外周血，那 KIR+CD8+T 细胞是否也存在于自身免疫病病人的器官或者组织里呢？对于这一问题，黎静分析了已发表论文中的自身免疫病组织的单细胞转录组数据，以及 CeD 病人的小肠活体组织，她发现狼疮肾炎病人的肾脏、类风湿性关节炎病人的关节液以及 CeD 病人小肠中 KIR+CD8+T 细胞的数量增多，并且与 CeD 的疾病进展正相关。  （来源：Science） 2020 年 3 月，该团队将以上成果整理成论文向 Nature 投稿，但遭到拒稿，同时新冠疫情开始在美国爆发。政府颁布了居家令，研究团队只能居家办公，实验无法继续进行。2020 年 5 月，他们看到新闻报道说新冠病毒感染会在病人中引起自身免疫反应相关的并发症，比如部分儿童在感染新冠病毒后出现川崎病。 于是他们猜想，KIR+CD8+T 细胞可能在传染病中抑制引发自身免疫反应的细胞，这种机制有利于机体维持一个完整的 TCR 库以应对新病原体的威胁，同时避免对自身抗原有交叉反应的 T 细胞对机体造成损害。 而黎静所在实验室的合作者、斯坦福大学医学院的卡里·纳多（Kari Nadeau）团队在新冠爆发初期就开始收集新冠病人的样品，经过一系列有关实验室生物安全的训练和审核后，黎静对 53 例新冠病人的 PBMCs 进行了分析，发现新冠病人中 KIR+CD8+T 细胞的比例明显高于健康人，而且与疾病严重程度正相关。 此外，伴有血管炎并发症的新冠病人的 KIR+CD8+T 细胞的水平更高，而血管炎有可能由自身免疫反应诱发，因此 KIR+CD8+T 细胞的升高可能与新冠病毒感染引起的自身免疫反应相关。这时，他们再次向 Nature 投稿，一个月后收到了审稿人提出的意见和建议。 “我那时正好怀孕了，但还是坚持补实验完善文章，12 月提交修改稿后仍被拒稿。2021 年 1 月我们向 Cell 投稿，编辑比较看好我们的工作，其中一个审稿人的评价也比较正面，但在等待其他审稿人的意见时，原来的编辑休产假了，换成了另一个编辑，其中有一个审稿人的意见的评价比较负面，因此我们又被拒稿了。”她说。 之后，她和同事又尝试投 Nature Medicine，但编辑认为论文的临床相关性不够因此没有送审。最后，他们决定试试 Science。在休了六周产假后，黎静就收到了审稿人的意见，主要问题还是集中在没有证据说明对 KIR+CD8+T 细胞在传染病中的功能，但编辑给了她一年内重新投稿的机会。 这时，黎静所在实验室向实验动物伦理协会申请的小鼠病毒感染实验终于获得了批准，于是，她和同事利用基因编辑的方法特异性去除小鼠体内的 Ly49+CD8+T 细胞并建立小鼠 LCMV 和流感病毒感染模型，发现这类 CD8+ 调节性 T 细胞不参与抗病毒免疫反应的调控，但可以抑制病原体感染引发的自身免疫反应，这也让最初的猜想得以证明。最后终于获得了审稿人和编辑的一致认可，最终论文被接收并发表于 Science。  （来源：Science） 在应用前景上，KIR+CD8+T 细胞可作为用于预测自身免疫病或病原体感染引起的自身免疫反应相关炎症的发生、进展和预后的生物标志物。而且，可开发阻断 KIR 抑制性信号的抗体或小分子药物，通过激活 KIR+CD8+T 细胞的免疫抑制功能来治疗自身免疫病以及传染病诱发的自身免疫相关并发症或后遗症（例如新冠长期症状）。 未来，黎静希望成立自己的实验室，深入研究促进 KIR+CD8+T 细胞分化、扩增和激活的因素，KIR+CD8+T 细胞如何选择性地靶向致病性 CD4+T 细胞以及致病性 CD4+T 细胞如何实现免疫逃逸，并开发靶向 KIR+CD8+T 细胞的新型免疫疗法。 本科毕业于清华，对免疫调节点有着深度研究  据介绍，黎静是广州人。2009 年本科入学，就读于清华大学医学药学实验班（3+2+3项目），在完成三年本科课程后，与 2012 年前往美国匹兹堡大学医学院访学，在医师科学家罗伯特·费里斯（Robert Ferris）教授的指导下进行了免疫调节点 PD-1 下游信号通路研究、PD-1 对 Tim-3 下游信号的影响、EGFR 单抗对髓系细胞的表型的影响等研究，相关研究论文分别发表于 Cancer Research、Oncoimmunology、Journal of Immunotherapy for Cancer 等杂志。 2014 年回国后，她加入清华大学董晨教授的实验室读博，研究另一免疫调节点 B7S1 在抗肿瘤免疫反应中的功能，发现 B7S1 和 PD-1 作用于共同的下游信号分子来协同地诱导 T 细胞耗竭，B7S1 和 PD-1 抗体联合用药可以进一步激活 CD8+T 细胞的抗肿瘤活性，之后她又研究了转录因子 Eomes 如何导致 T 细胞耗竭，研究论文分别于 2018 年 4 月和 2018 年 10 月发表于 Immunity 和 Frontiers in Immunology 杂志。 2018 年 10 月至今，她作为博士后在美国斯坦福大学马克·戴维斯（Mark Davis）教授实验室工作。 -End- 参考： 1.D. R. Koh et al., Less mortality but more relapses in experimental allergic encephalomyelitis in CD8-/- mice. Science 256, 1210-1213 (1992). 2.H. Jiang, S. I. Zhang, B. Pernis, Role of CD8+ T cells in murine experimental allergic encephalomyelitis. Science 256, 1213-1215 (1992). 3.H. J. Kim et al., CD8+ T regulatory cells express the Ly49 Class I MHC receptor and are defective in autoimmune prone B6-Yaa mice. Proc Natl Acad Sci U S A 108, 2010-2015 (2011). 4.H. J. Kim, B. Verbinnen, X. Tang, L. Lu, H. Cantor, Inhibition of follicular T-helper cells by CD8(+) regulatory T cells is essential for self tolerance. Nature 467, 328-332 (2010). 5.N. Saligrama et al., Opposing T cell responses in experimental autoimmune encephalomyelitis. Nature 572, 481-487 (2019). 6.J. Li et al., KIR(+)CD8(+) T cells suppress pathogenic T cells and are active in autoimmune diseases and COVID-19. Science 376, eabi9591 (2022). |
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