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自古以来，反馈原理就被用来调节和限制内在的不稳定性，破坏负反馈和相关的体内平衡会对细胞产生不利影响，比如在哺乳动物中，破坏TNFα或p53的负反馈调节会诱导程序性细胞死亡，在细菌或真菌中，破坏回路能分别降低趋化性和信号转导【1-3】。此外，许多微生物和肿瘤会表现出很高的突变率，由此产生的遗传多变性往往会导致能躲避治疗的抗性变体。从这些角度来看，破坏反馈回路可能是一种有效的治疗策略。 2022年5月12日，来自美国格莱斯顿研究所的Leor S. Weinberger团队在Cell杂志上发表了一篇题为Disrupting autorepression circuitry generates ''open-loop lethality’’ to yield escape-resistant antiviral agents 的文章，在这项研究中，他们发现工程化的DNA双链可以破坏孢疹病毒立早基因（IE）座负反馈环路，增加其胞内蛋白水平，从而在感染细胞中产生“开环致死率”，即引起宿主细胞“超载”进而死亡，这种策略不仅可以产生高效的抗病毒作用，同时还可以解除耐药性产生的屏障。除了孢疹病毒之外，该方法还可以广泛推广到SARS-CoV-2等RNA病毒当中。
基于破坏反馈环路的概念，研究人员首先考虑顺式调节DNA结合位点的分子模拟物是否能充当竞争性抑制剂，即反馈干扰分子（feedback-disruptor, FD），来打破反馈平衡提高病毒的表达水平以达到细胞毒性水平，并通过计算预测FD的功效（图1A-B）。随后，他们通过86-kDa IE蛋白（IE86）同源多聚体的结合来鉴定可能充当IE FD的DNA双链，并开发一种体外测定法来量化各种双联在催化IE86 蛋白-DNA复合物形成中的效率（图1D），其中，28 bp DNA双联显示出最大结合。为了测试它对细胞中反馈环路的破坏力，研究人员使用一种稳定转导的ARPE-19细胞系（图1E），双链体显著增加了IE86-GFP表达并导致大量细胞死亡，因而将该双链体（下文标记为FD86）视为IE86反馈环路的候选干扰物。
A. FD分子破坏转录负反馈环路的示意图。B. 计算模型显示FD可有效打破反馈以增加IE蛋白水平。D.为测试用于催化 IE86 C末端片段蛋白同源多聚化的不同长度 DNA 双链体的示意图。E. 在ARPE-19细胞（反馈报告细胞）中稳定表达的最小IE负反馈环路示意图。 为了确定FD86诱导细胞死亡的机制，研究人员对转染了FD86或FD乱序对照（FDScram）的反馈报告细胞进行了RNA-seq分析，鉴定出649个差异表达基因，其中，凋亡途径显着丰富，TUNEL染色也表明FD86在IE86能够促进细胞凋亡，而没有证据指示先天免疫或炎症通路得到激活。 那么这种方法是否可以推广到其他孢疹病毒呢？研究人员试图开发HSV-1 FD（FD175），与上述结果类似，FD175也能破坏病毒的自身抑制并增加表达>10倍。这种反馈破坏激活了多种细胞死亡途径，其中铁死亡占主导地位。不仅如此，研究人员还测试了FD是否也能对SARS-CoV-2发挥作用，他们首先推定NSP15蛋白与病毒基因组RNA（gRNA）上的转录调控序列（TRS）相互作用以抑制病毒蛋白的gRNA复制、转录和下游翻译，并设计了FD TRS RNA转染被SARS-CoV-2感染的细胞。结果显示，FD TRS RNA同样能显著增加gRNA和细胞凋亡水平，说明这种方法也能发挥对RNA病毒的抗病毒作用。 由于传统的治疗方法多会引起耐药株的出现，研究人员再次评估了FD是否能打破耐药性的限制。与传统的抗病毒试剂fomivirsen在第3-4轮感染即出现耐药性相比，FD在第一轮将CMV滴度降低100倍，在第52天稳定降至检测限以下，且没有观察到CMV抗性的证据。类似的，HSV-1对ACV的抗性在两轮内出现，而FD175在第40天稳定地将HSV-1滴度降低到低于检测水平，没有增加滴度或抗性的证据。 过度表达细胞毒性蛋白质的治疗机制的一个潜在问题是这些蛋白质将从垂死的细胞中释放出来，并对未感染的旁观细胞具有细胞毒性。为了验证这一假设，开发了一种旁观细胞共培养试验，该试验显示受感染细胞中FD介导的细胞凋亡显着，但旁观细胞中并没有。此外，研究人员还发现FD86与传统抗病毒药物GCV或ACV的组合使用能够在单独使用的基础上，使病毒滴度进一步的降低（图2）。除了这些体外检测结果，研究人员构建了HSV-1角膜感染小鼠模型，FD175治疗导致小鼠角膜中HSV-1感染细胞的百分比显着降低，将病毒滴度降低150倍。为了测试FD是否达到足以抑制体内全身感染的浓度，他们使用mCMV全身感染模型并通过纳米颗粒递送破坏mCMV IE3（IE88）反馈环路的FD，同样能使得病毒IE88基因表达显著增加，病毒滴度降低。
图2. 开环杀伤力不会导致旁观细胞死亡，且组合疗法更优。 总体而言，这些数据表明，竞争性抑制DNA或RNA蛋白质相互作用以破坏负反馈回路的诱饵可以产生开环杀伤力。FD诱饵增加而非减少转录因子水平，从而打破体内平衡。反馈中断策略能够产生针对多种疱疹病毒的抗病毒开环致死率，打破传统疗法构筑的耐药性屏障。虽然这项研究侧重于病毒反馈回路，但原则上，可能也能针对其他微生物或肿瘤中的反馈回路。此外，从基因调控网络的角度来看，反馈环路包括相互关联的正反馈和负反馈，如果耦合正负反馈架构，或许能放大开环杀伤力的影响。 原文链接： https:///10.1016/j.cell.2022.04.022 参考文献 1. Alon, U., Surette, M.G., Barkai, N., and Leibler, S. (1999). Robustness in bacterial chemotaxis. Nature 397, 168–171. 2. Yu, R.C., Pesce, C.G., Colman-Lerner, A., Lok, L., Pincus, D., Serra, E., Holl, M., Benjamin, K., Gordon, A., and Brent, R. (2008). Negative feedback that improves information transmission in yeast signalling. Nature 456, 755–761. 3. Harris, S.L., and Levine, A.J. (2005). The p53 pathway: Positive and negative feedback loops. Oncogene 24, 2899–2908. |
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