 作者：王子文 摘要： 研究目的:放射性溃疡是常见的皮肤或黏膜放射损伤，主要见于职业性或意外事故受照射、骨髓移植后放疗或癌症患者放射性治疗以及战时核辐射等。 近年来，尽管放疗技术有很大提高、射线设备不断完善、控制良性疾病的放射治疗以及加强对放射区域正常组织的防护，出现严重放射性损伤的概率逐渐降低，但是在治疗恶性肿瘤中放射治疗的应用越来越广泛，患者非癌组织仍然遭受着不同程度的非特异性辐射损伤。当溃疡发生后，局部感染加上放射效应的持续性和旁效应，如果没有及时治疗，很容易引起溃疡面加大加深，从而造成巨大的溃疡，甚至引起全身感染、急性出血等危及生命的事情发生。 伤口愈合的生理过程包括4个阶段：止血、炎症、增生和重塑阶段。然而，放射性溃疡与正常创面愈合阶段相比，不能有序、及时地进行。 一般来说，放射性溃疡会阻滞在炎症阶段，诱导创面持续的炎症反应，从而延缓创面的修复和愈合。放射性溃疡给病人带来极大的痛苦，损害他们的生活质量，并需要巨大的医疗资源。这些慢性伤口会持续数年，有些甚至会导致截肢。放射性溃疡的组织重建对整形外科医生构成了巨大的挑战。抗炎药、生长因子、局麻药物在临床上通常用于减轻放射性溃疡，但是效果不佳。 Palifermin（一种重组人角质形成细胞生长因子）是FDA批准的唯一一种预防骨髓移植患者口腔黏膜炎的靶向药物，但其受体（FGFR2β）经常在癌细胞中过度表达，有增加肿瘤生长的风险。同时，高压氧治疗也被认为是减少放疗后皮肤溃疡的有效方法，但治疗时间很长。因此，临床上亟需一种安全有效的能够减轻放射性溃疡的药物。 目前，放射性溃疡发生发展的机制仍不太清楚。电离辐射可以直接诱导DNA损伤或者增加自由基和活性氧（ROS）的生成间接促进基因表达修饰和DNA的损伤。不同类型和水平的DNA损伤引起不同的细胞反应，其中一种是通过短暂激活细胞周期检查点和DNA修复来促进细胞生存，另一种是激活细胞死亡程序或细胞衰老过程来抑制不可修复细胞的增殖。 其中细胞衰老是一种细胞周期阻滞不可逆的状态，辐射诱导的持续性DNA损伤反应（DDR）通过激活p16INK4a-RB和p53-p21CIP1信号通路，从而诱导细胞周期阻滞和细胞衰老。细胞衰老在胚胎发育、器官形成、创伤愈合和肿瘤抑制等方面起着重要作用。 在组织中，细胞衰老的影响可能是有益的，也可能是有害的，这取决于触发因素、组织和细胞类型。在细胞水平上，衰老细胞在组织中的长期存在会造成持久的炎症反应，从而使组织受损以及延缓修复和再生。 与此同时，衰老细胞会分泌大量促炎因子，包括细胞因子、趋化因子、基质重塑蛋白酶和生长因子等，统称为衰老相关分泌表型（SASP）。这些SASP通过旁分泌的方式导致组织功能障碍和创面恶化。然而，细胞衰老与放射性溃疡之间的关系尚不清楚。 3’-脱氧腺苷（虫草素），是一种在蛹虫草中发现的核苷类似物。由于其潜在的治疗价值和生物学价值引起了人们的广泛关注。 3’-脱氧腺苷能与癌症、肿瘤、炎症、氧化剂、mRNA的聚腺苷酸化等多种药物靶点相互作用，具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎症、神经保护、防止骨质流失等多种药理活性。然而，3’-脱氧腺苷能否抑制电离辐射诱导的细胞衰老和减轻放射性溃疡有待进一步探索。 在本研究中，首先建立了三种放射性溃疡模型：大鼠放射性皮肤溃疡、小鼠肠道溃疡和小鼠口腔黏膜炎。首次发现了DNA损伤和细胞衰老在放射性溃疡中持续存在，衰老细胞可能参与放射性溃疡的发展过程。 接下来，建立了辐射诱导的体外成纤维细胞衰老模型，筛选出3’-脱氧腺苷能有效降低辐射诱导的DNA损伤和细胞衰老。同时3’-脱氧腺苷能减轻放射性溃疡以及辐射诱导的长期损伤。最后，我们探讨了3’-脱氧腺苷抑制细胞衰老和减轻放射性溃疡的机制，研究了3’-脱氧腺苷可能的作用靶点，为发展更有效的放射性溃疡治疗策略提供了新的实验依据。 研究方法：1．衰老细胞在放射性溃疡中的分布特点研究 用40Gy局部辐照Sprague-Dawley（SD）大鼠右后腿，建立大剂量皮肤放射性溃疡模型。在不同时间点取材，通过HE染色观察皮肤的大体损伤情况；为了评估DNA损伤和衰老细胞在放射性溃疡发展中的存在情况，用免疫荧光检测DNA损伤相关蛋白（γ-H2AX）表达、β-SA-gal染色检测组织中衰老细胞的水平、Western-blot检测γ-H2AX和衰老相关蛋白（p16和p21）的表达、qRT-PCR检测衰老相关分泌表型（SASP）IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA水平；为了评估衰老细胞在放射性溃疡发展中的作用，我们把衰老细胞移植到受辐照大腿的皮下并观察腿部的变化。 2．3’-脱氧腺苷抑制细胞衰老的体外效应研究 分别用不同剂量（0、5、8Gy）辐照细胞，建立体外诱导的放射性细胞衰老模型；用Western-blot检测3’-脱氧腺苷处理细胞不同时间后抗氧化相关蛋白酶SOD1、SOD2、GPX-1和Catalase的表达； 通过流式细胞术检测3’-脱氧腺苷处理细胞后降低辐射诱导的总ROS和线粒体ROS的能力；通过Western-blot检测γ-H2AX的表达和免疫荧光染色检测细胞核内γ-H2AX的表达，来评估3’-脱氧腺苷处理细胞后抑制电离辐射诱导DNA损伤的能力； 为了评估3’-脱氧腺苷抑制电离辐射诱导的细胞衰老和衰老相关的分泌表型（SASP），通过Western-blot检测衰老相关蛋白p16和p21表达水平、SA-β-gal染色检测衰老细胞的水平、qRT-PCR检测衰老相关促炎分泌表型（IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8、MMP-3、MMP-12和PAI-1）的mRNA水平和CCK-8实验检测细胞增殖； 为了评估3’-脱氧腺苷促进细胞的集落形成能力以及减轻氧化应激诱导的细胞凋亡能力，进行了集落形成实验、流式细胞术检测细胞凋亡。 3．3’-脱氧腺苷减轻放射性溃疡的在体效应研究分别用40Gy辐照SD大鼠右后腿、12Gy辐照C57BL/6J小鼠腹部、15Gy辐照C57BL/6J小鼠头颈部，建立皮肤溃疡、肠道溃疡和口腔黏膜炎三种放射性溃疡模型。 4．3’-脱氧腺苷抑制细胞衰老和减轻放射性溃疡的机制研究研究结果：1．大剂量照射（40Gy）可以引起皮肤难愈合的放射性溃疡，为后期筛选减轻放射性溃疡的药物提供了稳定的模型；免疫荧光染色和Wester-blot检测表明，DNA损伤标志物和蛋白（γ-H2AX）在放射性溃疡中持续存在；在放射性溃疡中发现了持续存在的衰老细胞标志（SA-β-gal）和周期阻滞诱导的衰老相关蛋白（p16和p21）；同时qRT-PCR结果表明，衰老相关的促炎因子（IL-1β,IL-6和TNFα）在溃疡皮肤中高表达；受辐照的皮肤在皮下移植衰老细胞后，放射性溃疡发展的速度明显加快，红肿和溃疡程度更严重。上述结果表明，衰老细胞可能参与放射性溃疡的发展过程。因此抑制细胞衰老或者清除衰老细胞可能是减轻放射性溃疡的治疗策略。 2．建立了成纤维细胞体外诱导衰老模型，Western-blot结果表明，3’-脱氧腺苷显著增加细胞内SOD1、SOD2、GPX-1和Catalase抗氧化相关蛋白酶的表达，提示3’-脱氧腺苷可能会减轻电离辐射诱导的氧化应激损伤； 通用型ROS荧光探针DCFDA和线粒体特异性ROS荧光探针Mito sox red分别检测细胞内总ROS和线粒体ROS，3’-脱氧腺苷可以显著降低细胞内ROS的生成； Western blot和免疫荧光分别检测辐照后γH2AX的表达，3’-脱氧腺苷可以抑制电离辐射诱导的γH2AX水平，同时加快DNA损伤的修复；3’-脱氧腺苷降低电离辐射诱导的细胞衰老相关蛋白p16和p21的表达，减轻β-半乳糖苷酶的生成； 同时3’-脱氧腺苷处理的细胞衰老相关的促炎分泌表型（SASP）IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8、MMP-3、MMP-12和PAI-1表达水平降低；3’-脱氧腺苷促进正常细胞和辐照后细胞的集落形成能力，以及减轻电离辐射和双氧水诱导的细胞凋亡，提示3’-脱氧腺苷能够抑制电离辐射损伤并维持干细胞的功能。 研究结论：1．通过放射性皮肤溃疡动物模型，发现DNA损伤和衰老细胞在放射性溃疡中持续存在；通过皮下移植衰老细胞，证明衰老细胞能够促进放射性溃疡的进展。因此抑制细胞衰老或者清除衰老细胞可能是减轻放射性溃疡的治疗策略。 2．通过体外建立辐射诱导的成纤维细胞衰老模型，筛选出3’-脱氧腺苷能显著抑制电离辐射诱导的氧化应激损伤和细胞衰老。也首次证明了通过促进NRF2的表达可以抑制电离辐射诱导的成纤维细胞衰老。 3.建立了三种放射性溃疡模型（大鼠皮肤溃疡、小鼠口腔黏膜炎和小鼠肠道溃疡），进一步明确3’-脱氧腺苷能减轻放射性溃疡、抑制组织细胞衰老和DNA损伤。3’-脱氧腺苷是潜在的抑制细胞衰老和减轻放射性溃疡的药物。 4.3’-脱氧腺苷与AMPK蛋白α1亚基和γ1亚基结合，然后促进Keap1蛋白的p62依赖性自噬降解，诱导NRF2从Keap1解离并转运至细胞核，通过激活AMPK-NRF2信号通路来抑制细胞衰老和减轻放射性溃疡。本研究揭示了3’-脱氧腺苷激活AMPK的新机制，这一机制被证明在抑制细胞衰老和减轻放射性溃疡中发挥着重要作用。 与此同时，AMPK调节抗氧化反应的机制仍不清楚，本研究证明了激活NRF2是AMPK调节抗氧化反应的一种途径。AMPK或NRF2可能是抑制细胞衰老和减轻放射性溃疡的潜在治疗靶点。 |
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