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文献分享——2014-在白血病患者中识别Pre-leukaemic HSCs
内容目录
前言关于作者背景知识克隆性造血相关内容白血病细胞相关内容NPM1基因PART1-非白血病细胞中DNMT3A突变的检测PART2-DNMT3A突变的HSCs仍可多系分化PART3-Pre-leukaemic HSCs可以耐受化疗PART4-Pre-leukaemic HSCs的克隆扩增讨论后记
前言
今天回过头来看之前看过的一篇文章，发现有的居然已经忘了一大半了，又得从头来看，真的比较费时间。所以，干脆一次辛苦，方便以后了，把主要的内容整理成笔记好了。
这次的文章是以色列威茨曼研究所的Shlush在2014年发表在Nature上的一篇研究：
论文标题：Identification of pre-leukaemic haematopoietic stemcellsinacuteleukaemia
论文地址：https://www./articles/nature13038
关于作者
这里有2个共一作者：Liran I. Shlush 和 Sasan Zandi，通讯作者是John Dick。
其中关于Shlush，我们都相对比较熟悉了，目前在威茨曼研究所。Zandi和Shlush一样，过去都是在John Dick Lab里做研究，现在也都毕业了。
放一个他们lab的网站，有兴趣的话自己去看看吧：
John Dick Lab：http://www./
背景知识
克隆性造血相关内容
白血病细胞相关内容
CD33是髓系细胞分化抗原，分子量为67KD，主要分布在髓系血细胞，特别是在分化的早期阶段。CD33在90%以上的急性髓系白血病患者都有表达。
这里要注意：CD33是可以在髓系血细胞表达的，如果想要表示AML中blast细胞，则还要加上CD45dim
NPM1基因
NPM1基因位于染色体5q35，其编码的核磷蛋白具有多种重要的功能，如阻碍核仁蛋白的聚集，调节核糖体蛋白的装配以及这些蛋白在核与质之间的转运，启动中心体的折叠，具有分子伴侣作用，并可通过多种信号通路调节细胞增殖和凋亡。NPM1 基因突变在 AML 的发生和发展中起到重要的作用。
NPM1突变常发生于12号外显子，目前报道的有40多种不同的突变类型, 其中以A型突变最常见，约占70%-80%，表现为在第960-961位核苷酸之间插入TCTG。
尽管NPM1突变的类型不一，但均属于移码突变，导致核定位信号异常，从而使核磷蛋白由核内易位于胞质，该异常定位不但可影响蛋白质的正常功能，同时对某些肿瘤抑制基因ARF、P53 的正常通路及功能也产生一定的影响。
NPM1基因突变的发生率在FAB各亚型中亦具有异质性，见于除M3外的各亚型，在M4和M5中发生率较高。
NPM1基因突变是AML预后相对较好的判断指标。这可能与NPM1突变患者对化疗药物较敏感有关。研究发现在AML中，核转录因子NF-KB的活化是白血病细胞对化疗药物产生耐药性的主要原因，在NPM1突变的白血病细胞中，核磷蛋白由核内易位于胞质，与胞浆中的NF-KB蛋白相互作用，导致NF-KB被分解，活性降低，从而减弱NF-KB与DNA的结合能力，提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。
注意：当NPM1基因突变后，可以直接写成NPM1c
PART1-非白血病细胞中DNMT3A突变的检测
使用深度靶向测序技术，对12个初诊AML患者的外周血DNA进行靶向测序，主要针对的靶基因有103个：
| ABL1 | ADAR | ADARB2 | ASMTL | ASXL1 | ATM | BCOR |
|---|
| BCORL1 | BRAF | CBL | IL3RA | CD44 | CDH23 | CDKN2A |
| CDKN2B | CEBPA | CHD2 | CNOT3 | CREBBP | CRLF2 | CSF1R |
| CSMD3 | DDX3X | DNMT3A | DNMT3B | EBF1 | ECT2L | EED |
| EGR2 | EP300 | EZH2 | FBXW7 | FLT3 | GATA1 | GATA2 |
| GATA3 | GLI1 | GLI2 | HELLS | HNRNPA1 | HNRNPR | HRAS |
| HYDIN | IDH1 | IDH2 | IKZF1 | IL7R | JAK1 | JAK2 |
| JAK3 | KIT | KLHL6 | KRAS | LPHN3 | LRP1B | MECOM |
| MED12 | MLH1 | MLL | MPL | MSH2 | MSH6 | MUC2 |
| MUC4 | MYD88 | NF1 | NOTCH1 | NPM1 | NRAS | NXF1 |
| PAX5 | PCLO | PDGFRA | PDGFRB | PHF6 | PIK3CA | PIM1 |
| POT1 | PTEN | PTPN11 | RELN | RIMS2 | ROR1 | RUNX1 |
| SEMG2 | SF3B1 | SI | SIRPA | SLC4A10 | SMC3 | SMO |
| SRSF2 | SUZ12 | SYK | TBL1XR1 | TET2 | TP53 | TP53INP1 |
| TTN | U2AF1 | UMODL1 | WT1 | XPO1 |
|
|
主要针对CD33+的AML细胞和作为正常对照的T细胞进行测序：
4/12人有DNMT3A突变（9，10，11，12）
3/4人中正常T细胞内也可以找到突变（9，11，12）
在AML细胞中的DNMT3A突变VAF值较高，而正常T细胞中的DNMT3A突变VAF值较低
为了看一看在AML患者中DNMT3A突变的情况，作者又找来一批样本——71个确诊为AML的患者，取初诊时患者体内正常遗传学的血细胞进行一代sanger测序：
找到这些样本后，对这17个人做ddPCR（定量分析）检测VAF值，结果如上图：
又对其中2个样本检测了FLT3-ITD：
可以看到其中：在CD33+的AML细胞中可以发现有FLT3-ITD的存在，而在正常T细胞中基本上没有，在第2个患者中的MLP细胞中有发现。
由此作者推断说，突变发生有一定的顺序：
早期先有DNMT3A突变
而后出现NPM1c和FLT3-ITD
这样推断的话，其实也还算是有逻辑性的吧。
PART2-DNMT3A突变的HSCs仍可多系分化
为了探索DNMT3A突变细胞起源，因为目前认为DNMT3A先在正常细胞中出现，慢慢发展到AML细胞中，所以于是对11个DNMT3A突变/NPM1c的AML个体中正常细胞（CD33-）进行测序。
同时取了3个时间点的样本——初诊、缓解和复发。
关于流式分选策略：
CD33- CD34+ CD45dim CD38- ：
MLP：CD45RA+
HSC：CD90+ CD45RA-
MPP：CD90- CD45RA-
CD33- CD34+ CD45dim CD38+ CD7- CD10- ：
CMP：CD45RA- CD135+
MEP：CD45RA- CD135-
GMP：CD45RA+ CD135+
作者对上述分选出来的AML患者体内正常HSPCs细胞和AML中blast细胞（CD33+ CD45dim）进行ddPCR对DNMT3A和NPM1c做定量检测：
上面的图a和下图b都是一个比较典型的患者数据——no.11号患者：
从图a中可以得到的结论有（细胞数量差异）：
从图b中可以得到的结论有（克隆大小差异）：
在初诊时，NPM1c克隆相对较小，只有GMP和Blast细胞中存在。在复发转移时，NPM1c克隆则在成熟和不成熟细胞中均有表达，且GMP中NPM1c克隆长大了。
在缓解期间，NPM1c被全部清除。只有DNMT3A突变的存在。说明DNMT3A突变克隆不是AML致病克隆。
不同时间点下：在HSC/MPP细胞中，仅带有DNMT3A突变，而没有NPM1c突变。可能NPM1c并不是来自HSC中，而是从下游的祖细胞而来。
复发的Blast细胞中DNMT3A的VAF变小，可能是因为一旦发病后，DNMT3A就不再是主要的克隆，而慢慢减小。
下面对11个个体中的突变情况进行分析（不过文中没有具体说明这个样本的时间点，但是根据b图可以看出这个样本应该是在初诊时采集的）：
不成熟的HSPCs（如HSC、MPP、CMP、MEP、MLP和GMP）都可以检测到DNMT3A突变，而成熟细胞（如T、B和NK细胞）中很多没有DNMT3A突变。这一点的话和疾病相关吧，因为AML就是分化阻滞嘛，即使不成熟细胞中带有突变，在向下分化过程中肯定会有阻滞在某个阶段，然后成熟细胞中就带有较少的突变。
这里作者说这个证据可以说明DNMT3A突变可以促进AML中NPM1c的发生？？有点疑惑？？
有3个人的数据——10、16和14，他们在HSC/MPP时没有DNMT3A突变，而到了CMP时就有了DNMT3A突变，有2种解释：1）因为HSC/MPP时VAF比较低，检测技术测不到。2）可能这个突变是在HSC/MPP→CMP过程中获得的。
但是我发现有个患者非常奇怪——28号。HSC/MPP时就存在DNMT3A突变，到了CMP时却没有了？？到了MEP后又出现了，而且还是DNMT3A突变和NPM1c共存？？好像这个现象不局限于28号，在57、35、16、36、14中都有这个现象。
有想法的同学欢迎来讨论。
PART3-Pre-leukaemic HSCs可以耐受化疗
对下图有个详细的分析：
与初诊时相比，在缓解和复发时，DNMT3A突变的VAF值略高或基本一致。
初诊和复发时的CD33+的blast细胞会同时携带DNMT3A突变和NPM1c突变。而缓解期的CD33+细胞只有DNMT3A突变，说明这些细胞不是AML细胞，而是仅仅携带有DNMT3A突变的干祖细胞（具有向下分化的能力）
在复发的样本中，大多细胞类型都具有2个突变，而只有HSC和MPP细胞只带有DNMT3A突变。说明HSC/MPP细胞并不是真正的AML细胞，在HSC/MPP→CMP/MLP过程中可能获得新的突变，出现pre-leukaemic HSCs细胞。
no.57患者生存时间较长，所以可以通过观察这个样本，比较早期缓解（3个月）和晚期缓解（36个月）时DNMT3A突变的情况：
一些部分CD33+细胞，在缓解晚期（36个月）会出现类似初诊时同时携带DNMT3A突变和NPM1c的克隆，这说明：
小结：
因为在缓解和复发过程中，DNMT3A突变一直存在，所以认为Pre-leukaemic可以耐受化疗。
PART4-Pre-leukaemic HSCs的克隆扩增
为了检验DNMT3A突变的HSC是否有功能上的改变，在重建时是否有优势，作者进行了移植实验。
实验样本：
11号患者（HSC/MPP中DNMT3A的VAF=30%）和55号患者（HSC/MPP中DNMT3A的VAF=20%）中的外周血单个核细胞
极限稀释LDA移植到免疫缺陷小鼠股骨内
在移植后第8和16周流式分析检测股骨内的植入物细胞组成
白血病细胞植入物定义为：CD45dim CD33+
非白血病细胞植入物的话是一个混合物，认为既有淋系（CD19+B细胞），也有髓系细胞（CD33+）
其实这里我是有点疑问的，为什么只CD33这个来分析，非常矛盾，我们一般认为CD33是白血病细胞，正常髓系细胞的话可以用其他的marker吧？？
对于no.11患者：
no.11患者初诊和复发样本移植到小鼠16周时的数据结果：
说明与初诊时相比，复发时LSC数目更多。
又对于no.11患者比较不同植入物的组成以及VAF情况：
仅有DNMT3A突变的小鼠有9/12只，平均VAF=57%
同时有DNMT3A突变和NPM1c的有2只，其中12号的植入物中CD33细胞比例较高
只有一个植入物中超过50%的都是CD33+细胞（12号小鼠），植入物中DNMT3A和NPM1c的突变VAF都相对较高（是Blast细胞）。
又做了一个动力学实验，分别检测初诊时外周血样本，植入小鼠8周、16周后的植入物VAF：
关于这个图如何看：
图中第一列2个点分别是HSC和MPP中VAF的值
第二、三列中每个点代表一个小鼠中植入物的VAF值
可以得到的结论：随着时间的进展，DNMT3A突变的VAF越来越高。
个人觉得以上描述非常的混乱，所以我就简单写下我自己的理解：
通过图b，我们可以看到12号小鼠中，植入物数目是白血病blast细胞为主，而且突变信息验证了这一点。而3号小鼠中，植入物数目中白血病blast细胞相对于其他较多，但是突变信息中证实这些都是正常的细胞。
上面的数据表明：
HSC/MPP中发生DNMT3A突变可以向下继续分化。所以认为这样的细胞就是所谓的pre-leukaemic HSCs
DNMT3A突变可以带给pre-leukaemic HSCs一定的造血重建优势。
小鼠移植模型说明，当pre-leukaemic HSCs数目远远高于LSC时，会主要产生非白血病细胞植入物。
接下来作者用自己手上有的264历史临床AML样本移植到小鼠中的数据，总结了下移植物的细胞组成情况：
37%没有植入物
40%是白血病植入物
23%是非白血病植入物
于是作者又找到了手上有的历史数据——264个样本中有25个患者有一代sanger测序数据：
使用一代sanger测序方法对25个样本进行分析植入物的情况：
因为这是历史数据，所以没法确定到底这些植入物的来源是pre-leukaemic HSCs还是LSC。
前面证明了pre-leukaemic HSCs中是携带有DNMT3A的，那么pre-leukaemic HSCs会不会携带有IDH1/2呢？如果能证明pre-leukaemic HSCs中携带有IDH1/2也许也能说明前面的问题，这些植入物来源于pre-leukaemic HSCs。于是用ddPCR对52，64，77号患者初诊时的样本流式分选细胞分别进行检测NPM1c和IDH2的突变VAF：
讨论
确定了在白血病的发生过程中，DNMT3A→NPM1c及FLT3突变的大致顺序。
确定了在诊断时pre-leukaemic HSCs的存在，并且如果基于他们的数据，大概有25%的AML患者中有DNMT3A突变的存在。
确定了DNMT3A突变的HSC/MPP有重建的优势。
因为在缓解和复发过程中，DNMT3A突变一直存在，所以认为Pre-leukaemic可以耐受化疗，目前一些针对Pre-leukaemic突变的药物如IDH抑制剂之类的，也许可以在他们产生更强耐药性前彻底清除这些克隆。
后记
老实说，看Shlush的文章真的让人焦头烂额，可能还是自己没能达到那个层次吧，先这样吧😂
