  序言 Prokineticins是最近发现的在免疫系统和炎症疾病中重要的趋化因子，可能参与神经系统疾病的病理机制。长链脂肪酸乙酰辅酶A连接酶4（ACSL4）是花生四烯酸（AA）-PE合成的关键酶，已被证明诱发铁死亡的关键分子之一。江苏省人民医院神经外科季晶团队发现Prok2通过加速Fbxo10驱动的泛素化过程靶向降解ACSL4，从而抑制AA-PE的生物合成，减轻神经元细胞死亡。相关结果发表在2021年《nature communications》。 文献地址：org/10.1038/s41467-021-24469-y 研究背景 Prokineticin-2（Prok2）是一种重要的分泌蛋白质，虽然最初发现其生物活性与胃肠道运动的调节有关，后来的研究表明，它参与了成年斑马鱼的嗅球神经发生以及睡眠和唤醒状态调节。此外，Prok2在黑体多巴胺能神经元中发挥保护作用。然而，Prok2在TBI后神经元细胞死亡的作用尚未被研究。 铁死亡是一种新发现的细胞死亡形式，生化特征方面包括磷脂过氧化氢化合物积累，特别是HOO-AA-PE。Acsl4是AA-PE生物合成的关键酶，已被证明促进铁死亡发生。多种急性脑损伤疾病（如中风、TBI）和慢性神经退行性疾病（帕金森病和阿尔茨海默病）的发病机制与铁死亡有关。 在本研究中，笔者研究了Prok2在TBI后神经元铁死亡的作用和机制，证明Prok2提高了Fbxo10的水平。Fbxo10作为泛素连接酶进一步参与Acsl4蛋白的泛素化，促进了Acsl4的泛素化降解，进而发挥保护神经保护作用。 研究结果 TBI患者标本RNA-seq发现上调基因Prok2 从南京医科大学第一附属医院组织库获取3例非挫伤性脑组织和5例TBI挫伤脑组织进行转录组学分析。患者样本信息见表1。两组差异性最大的十个基因见表2。因为其他差异基因在神经元中表达水平较低，故选择Prok2进行进一步分析。   Prok2在TBI、牵张损伤和Erastin刺激后表达增加 Western blot和免疫荧光结果提示Prok2在TBI患者脑组织中表达显著升高（figure.1a-c）；CCI小鼠伤灶附近脑组织中Prok-2蛋白在损伤后逐渐升高（figure.1e-f）;荧光双染结果提示prok-2在神经元中显著表达，星形胶质细胞和小胶质细胞中低表达（figure.1g）；接着笔者采用原代神经元牵张损伤模型证明prok-2在损伤3h后表达明显升高，同时活化的caspase-3蛋白水平逐渐升高（figure.1j-k）。最后笔者采用铁死亡诱导剂Erastin刺激原代神经元发现prok-2同样明显升高（figure.1l-n）。   Figure.1 Prok2在TBI、牵张损伤和Erastin刺激后表达增加 过表达Prok2减轻Erastin诱导的细胞毒性 TUNEL染色结果提示过表达Prok-2显著减少细胞死亡比例，干扰Prok-2则显著增加细胞死亡比例，并且Fer-1可以显著降低干扰Prok-2的负面影响（figure.2c-d）。Perl’s染色结果提示过表达Prok-2显著降低细胞铁含量，干扰Prok-2则显著增加细胞铁含量，并且Fer-1可以显著降低干扰Prok-2带来的负面影响（figure.2f-g）。细胞活性和LDH释放检测结果趋势同上（figure.2h-i）。最后笔者发现在蛋白水平上过表达Prok-2导致ACSL4下调，GPX4上调，反之亦然。   Figure.2 过表达Prok2减轻Erastin诱导的细胞毒性 Prok2以Acsl4依赖的方式保护线粒体功能 Mito-Tracker染色结果显示Erastin刺激显著降低线粒体长度，增加线粒体圆度，过表达Prok-2逆转了这些改变（figure.3a-c），增加Tomm20阳性表达，促进线粒体迁移至神经突（figure.3d）。TEM结果显示Erastin刺激导致神经元出现铁死亡线粒体表现：线粒体皱缩，外膜破裂，过表达Prok-2干预后显著减轻这些改变（Figure.3e）。作者进一步干扰ACSL4表达后，发现相比于对照组，过表达Prok-2无法提供相应的线粒体保护作用或抑制铁死亡的作用（figure.3f-n）。   Figure.3 Prok2以Acsl4依赖的方式保护线粒体功能 Prok2促进Acsl4泛素降解 放射菌素D抑制mRNA合成后，过表达Prok-2发现对ACSL4 mRNA的水平无显著影响，提示机制并非通过影响mRNA稳定性（figure.4a）。CHX抑制蛋白合成后，与对照组相比，过表达Prok-2显著加速了ACSL4蛋白降解，提示机制涉及蛋白稳定性降低（figure.4b-c）。为了研究蛋白稳定降低机制为自噬降解途径或泛素化蛋白酶体途径，作者使用Bort和Baf A1分别抑制上述途径，结果提示抑制泛素化蛋白酶体途径时过表达Prok-2导致的ACSL4蛋白水平降低被逆转，而抑制自噬无法逆转（figure.4d-e）。作者进一步采用co-IP检测方法证明了ACSL4与泛素分子存在相互作用（figure.4f-h）；提前加入MG132抑制蛋白酶体降解途径后，过表达Prok-2导致的ACSL4蛋白水平下降被逆转，并且泛素化ACSL4水平升高（figure.4i-k）。 Figure.4 Prok2促进Acsl4泛素降解 Fbxo10在Prok2诱导的Acsl4泛素化中至关重要 为了识别Prok-2导致ACSL4泛素化降解过程中的关键E3连接酶，作者对ACSL4抗体免疫共沉淀产物银染结果展示了结合ACSL4蛋白条带，质谱分析识别出唯一的E3连接酶（Fbxo10）（figure.5a-b）。免疫荧光结果提示ACSL4和Fbxo10存在共定位(figure.5c)，Co-IP结果提示在Erastin刺激或未刺激条件下，过表达Fbxo10均增加Acsl4泛素化水平(figure.5d)。为了研究Fbox10结合Acsl4蛋白的具体位点，作者分别过表达了了Fbxo0的6-49肽段和460-867肽段。再次利用Co-IP检测发现过表达了460-867短肽结合了Acsl4蛋白，提示结合位点位于460-867肽段（figure.5e）。作者进一步研究Prok-2和Fbxo10的调控关系，结果提示在Erastin刺激或未刺激条件下，过表达Prok-2均增加Fbxo10蛋白水平（figure.5f）; 接着作者进一步研究Prok-2、Fbxo10和ACSL4三者的关系，结果提示在Erastin刺激或未刺激条件下，干扰Fbxo10均逆转过表达Prok-2导致的ACSL4泛素化水平升高和ACSL4蛋白降低（figure.5g-h）。 Figure 5. Fbxo10在Prok2诱导的Acsl4泛素化中至关重要 AAV-Prok2脑室注射液以Fbxo10依赖性的方式减少CCI小鼠损伤体积 通过eGFP荧光染色确定AAV-Prok2感染神经元，进一步在蛋白水平上验证过表达效率（figure.6a-b）。通过荧光素酶活体成像确定AAV-shFbxo10感染脑组织，进一步在蛋白水平上验证感染效率（figure.6c-d）。AAV-Prok2脑室内注射显著增加GPX4蛋白水平，降低ACSL4水平；这些变化在Fbxo10干扰后被逆转；Fer-1改善了Fbox10干扰后导致的GPX4降低（figure.6e-g）。AAV-Prok2脑室内注射减少损伤体积，这种变化被Fbxo10干扰所逆转；Fer-1改善了Fbox10干扰后导致损伤体积增大（figure.6h-i）。这种变化趋势同样表现在TEM、ACSL4免疫组化、GPX4免疫组化和TUNEL染色结果中（figure.6j-m）。 Figure 6. AAV-Prok2脑室注射液以Fbxo10依赖性的方式减少CCI小鼠损伤体积 AAV-Prok2改善了CCI小鼠神经行为结果 转棒实验和水迷宫实验结果提示，AAV-Prok2改善了CCI小鼠神经行为评分，AAV-shFxo10逆转了这种改变，Fer-1减少了AAV-shFxo10的负面影响改善了行为学评分。 Figure 7. AAV-Prok2改善了CCI小鼠神经行为结果 讨论 本研究确定了Prokineticin家族成员Prok2在TBI后病理生理学中的神经保护作用。作者证明了Prok2在TBI患者、CCI小鼠模型、前张损伤和Erastin刺激原代神经元模型证明Prok2在损伤后被迅速诱导表达。笔者推测神经元细胞Prok2表达升高是对铁死亡应激的保护性反应，但升高的程度不足以抵抗细胞死亡。 过表达Prok2可通过泛素化下调ACSL4水平发挥抗神经元铁死亡表型，挽救铁死亡相关的线粒体相关损伤，提示靶向Prok2蛋白可能对损伤神经元保护保至关重要。Fbxo0是一种E3连接酶，本研究发现了Fbxo10通过靶向泛素化降解ACSL4，减轻TBI诱导的神经元铁死亡，因此Fbxo10可能也具有潜在保护作用。另外使用AAV病毒作为基因载体的治疗策略存在不足，有研究报道使用AAV载体的基因治疗患者存在芳香L-氨基酸脱羧酶缺陷，并且这无法预测其发生。此外患者只有在受伤后才寻求治疗，本文未评估损伤后干预Prok2表达在预防TBI后神经元铁死亡方面的治疗潜力。 译者 神经外科学博士（在读） 就读于复旦大学附属华山医院，导师胡锦教授。 |
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