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面-肩-肱型肌营养不良症（FSHD）是临床常见的遗传性肌肉病，以选择性、非对称性面肌、肩带肌和上臂肌群进行性肌萎缩和肌无力为临床特征，目前尚无有效治疗方法。本文对FSHD诊断与治疗及其发病机制的研究历程进行回顾，并展望未来的研究方向。 一、临床诊断研究历程早在1885年，法国神经病学家Landouzy和Dejerine首次描述FSHD的临床特点：儿童期发病、累及面肌、与Duchenne型肌营养不良症（DMD）和脊髓性肌萎缩症（SMA）表现不同的进行性肌萎缩和肌无力。1950年，Tyler和Stephens详细报告了一家系的临床表型和基因突变特点，并正式将其命名为“facioscapulohumeral muscular dystrophy（FSHD）”。绝大多数FSHD患者呈常染色体显性遗传，20岁后外显率高达95%。根据遗传方式可分为两型，即FSHD1型和FSHD2型，其中，FSHD1型占95%，呈常染色体显性遗传；FSHD2型占5%，遗传方式多样，可呈常染色体显性或隐性遗传。FSHD的临床表型存在高度异质性，以面肌最先受累，尤其是与笑容相关的面肌在疾病早期即可发生肌无力症状，表现为闭眼不全或无力、吹口哨和鼓腮困难、唇厚而翘、表情减少等；然后逐渐出现肩带肌和上臂肌群症状且呈不对称性发病。然而，面肌无力症状通常不易察觉，至青少年期，患者多因上肢抬举无力、梳头困难而就诊。部分患者可同时存在躯干肌、骨盆带肌和下肢肌群肌无力症状，不伴心肌受累；尚可出现骨骼肌以外的症状或体征，多见于早发型病例，包括视网膜血管病变如表现为视网膜血管迂曲、闭塞、渗漏、毛细血管扩张或微动脉瘤的Coats综合征，高频（4000-6000Hz）音域听力明显损害、智力发育迟滞、癫痫发作等。FSHD患者病程进展缓慢，一般不影响生存期，但不同程度影响生活质量，约20%的患者50岁后需以轮椅代步。 二、分子学机制研究1. 致病基因的定位与分子诊断 1990年，Wijmenga等采用微卫星探针标记Mfd22（D4S171），经对荷兰10个FSHD家系进行连锁分析初步将FSHD致病基因定位于第4号染色体。次年，他们通过数目可变串联重复序列（VNTR）D4S139检测方法，进一步对9个FSHD家系进行多位点连锁分析和原位杂交（ISH）检测，最终将FSHD致病基因定位于第4号染色体亚端粒区（4q35-ter）。此后的研究采用不同的微卫星探针，对不同种族的FSHD家系进行连锁分析，均获得与Wijmenga等一致的研究结果：FSHD致病基因定位于4q35。1992年，全球6所研究机构（包括神经病学、儿科学、遗传病学实验室）对65个FSHD家系中的504例患者和559例正常对照者的3078种基因型进行连锁分析，发现4q35区域最可能的遗传顺序为4cen-D4S171-F11-D4S163-D4S139-FSHD-tel。Winokur等于1993年对一种仅包含人类第4号染色体的人-仓鼠体细胞杂交细胞株，即HHW416细胞株的134个克隆进行放射性杂交分析并构建4q35物理图谱，从而确定了4q35区域15个位点（包括基因、多态位点、单态位点）的DNA排列顺序。Wijmenga等于1992年从与4q35杂交的黏粒克隆13E中筛选出p13E-11探针，该探针与4q35-ter区域近端结合，探测由位于4q35区域的串联重复序列（长度为3.30×103bp，亦称D4Z4）组成的EcoR I限制性片段，并通过Southern blotting法（EcoR I/HindⅢ酶切基因组DNA与p13E-11探针杂交）检测4q35区域中与FSHD发病相关的DNA重组，结果显示，FSHD患者4q35区域存在短于正常人群的EcoR I限制性片段（长度<28×103bp），从此开创了FSHD的分子诊断研究。Wijmenga等认为FSHD发病机制可能即与EcoR I限制性片段缺失有关。然而，常规电泳检测技术仅适用于长度<50×10^3bp的DNA片段，而无法检测全长EcoR I限制性片段。1994年，Wijmenga等通过基于EcoR I/Hind III酶切基因组DNA脉冲场凝胶电泳（PFGE）联合p13E-11探针的Southern blotting法，不仅识别出长度为（30-320）×10^3bp的多态性DNA片段，并在所有样本中检出位于两种非等位基因座的多态性DNA片段，经单倍体型分析，一个基因座定位于4q35，另一个位于其他染色体；1995年，他们通过连锁分析将p13E-11探针识别出的非4q35区域多态性基因座定位于染色体10q-ter。与Wijmenga等同期开展分子学机制研究的还有Deidda等，该团队的研究显示，D4Z4串联重复序列除了4q35区域还可同时存在于10q26和1q12区域，其中4q35和10q26的EcoR I限制性片段呈高度同源，但仅有来源于4q35的截短EcoR I限制性片段与FSHD的发病有关，约10%来源于10q26的EcoR I限制性片段长度<38×10^3bp，但是该片段缺失并不致病，其研究结果对FSHD分子诊断技术的准确性提出了质疑。1996年，Deidda等又发现，来源于10q26的EcoR I限制性片段具有4q35未具备的Bln I限制性位点且可以被Bln I酶降解，而来源于4q35的EcoR I限制性片段具有10q26未具备的Xap I限制性位点，但是几乎不受Bln I酶的影响，仅缩短约3×103bp，因此得知，EcoR I+Bln I双酶切基因组DNA可以避免来自10q26的截短EcoR I限制性片段的干扰，从而提高了FSHD分子诊断的准确性和可靠性。1997年，Upadhyaya等在113例FSHD患者和200例正常对照者中验证了基于EcoR I+Bln I双酶切基因组DNA的Southern blotting技术的敏感性和特异性，以35×10^3bp作为临界值，其灵敏度为94.6%、特异度接近100%。因此，基于EcoR I+Bln I双酶切基因组DNA脉冲场凝胶电泳或琼脂糖凝胶电泳联合p13E-11探针的Southern blotting法不仅可以对FSHD1A型进行有效的分子诊断，并可用于产前诊断。已知FSHD1型的发病与定位于4q35的D4Z4重复序列整倍缺失有关，正常人群4q35区域中包含11-150个D4Z4拷贝数，而95%的FSHD患者4q35区域中仅包含1-10个D4Z4拷贝数并与其临床表型严重程度（发病年龄、疾病进展等）呈负相关，D4Z4拷贝数越少、发病年龄越早、疾病进展越迅速、越可能出现骨骼肌以外的症状，存在1-3个D4Z4拷贝数的患者病情严重且多为散发病例，4-10个D4Z4拷贝数的患者均有家族史；此外，同一家系中D4Z4拷贝数通常是恒定的。随着越来越多的FSHD家系和非典型FSHD分子遗传现象被报道，分子诊断技术需进一步改进。有研究显示，4q35与10q26的D4Z4重复序列高度同源，二者易位发生率较高，有20%的荷兰正常人群存在4q35与10q26的同源重组，10q26的D4Z4重复序列易位至4q35，若易位后的D4Z4重复序列长度短于正常片段（<38×10^3bp）即可能致病，反之不致病。虽然，基于EcoR I+Bln I双酶切基因组DNA脉冲场凝胶电泳联合p13E-11探针的Southern blotting技术检测4q与10q易位的准确性较高，但该方法需制备高质量的DNA，对技术操作要求高，所需仪器费用昂贵，非一般实验室能够配备，使其在临床推广应用较为困难。然而，常规琼脂糖凝胶电泳技术无法检出4q与10q易位，并可能存在假阳性结果。Vander Maarel团队在传统Southern blotting法基础上建立了BglⅡ-Bln I剂量检测方法，经BglⅡ+Bln I双酶切基因组DNA后，通过判断来自4q和10q杂交片段长度不一致，鉴别4q型和10q型DNA片段，如果4q35与10q26未发生易位，4q与10q杂交片段信号强度比值为2∶2；若4q与10q杂交片段信号为1∶3或3∶1，则提示4q35与10q26发生易位，该项技术在传统Southern blotting法基础上成功地检出了4q35与10q26易位，自此FSHD常规分子诊断的准确性和敏感性明显提高。FSHD的发病需特定的第4号染色体单倍体型，4q35-ter区存在4qA和4qB两种单倍体型，二者随机出现于正常人群，但仅D4Z4重复序列整倍缺失的4qA单倍体型与FSHD发病有关；因此采用基于EcoR I+Bln I双酶切基因组DNA脉冲场凝胶电泳或琼脂糖凝胶电泳联合p13E-11探针的Southern blotting技术，再结合4qA或4qB探针即可检测两种单倍体型的表达水平。通过检测D4Z4重复序列近着丝粒端的简单序列长度多态性（SSLP），可将4q35-ter进一步分为多种单倍体型，其中4qA单倍体型包括4qA159、4qA161、4qA163、4qA166和4qA168，尤以4qA161最为常见，而4qA166不致病。总之，基于EcoR I+Bln I双酶切基因组DNA脉冲场凝胶电泳或琼脂糖凝胶电泳联合p13E-11探针的Southern blotting法可通过完整分离4q和10q同源性EcoR I区域的全部片段，从而直观分析各种复杂易位带型并判断体细胞嵌合，是目前FSHD分子诊断的“金标准”。但是由于该项检测技术操作高度复杂、对实验仪器要求极高，并存在放射性污染等缺点，从而大大限制了其在临床的应用。近年来，单分子荧光原位杂交（FISH）技术，亦称为分子梳（MC），开始应用于FSHD的分子诊断。该项技术在2011年由Nguyen等提出，是基于单分子DNA的荧光原位杂交技术，分辨率高达1×10^3bp；可使D4Z4重复序列可视化，通过不同荧光标记探针单次检测即可区分4q或10q来源，以及4qA或4qB单倍体型，判断体细胞嵌合。Vasale等分别采用传统Southern blotting法与分子梳技术对同一组样本进行检测，二者阳性检出率相近，但分子梳技术对判断体细胞嵌合、D4Z4重复序列临界值，以及Southern blotting法模糊结果更为敏感，由于样本量较小，其结论尚待大样本临床试验加以证实。 2. FSHD1型候选致病基因的筛选 约有95%的FSHD发病与4q35区域D4Z4重复序列整倍缺失有关，但其具体分子学机制和致病基因尚未阐明。目前在D4Z4重复序列内部及其邻近区域已发现多个候选致病基因，如DUX4、FRG1、FRG2、ANT1、DUX4C基因等，均与FSHD的发病密切相关，其中以针对DUX4基因的研究最为活跃。（1）DUX4基因的发现及其作用机制：D4Z4重复序列包含2个重复序列，即LSau和富含鸟嘌呤-胞嘧啶（GC）的低拷贝重复序列hhsp33，以及1个可读框（ORF），可读框又包含2个同源结构域，在其上游149bp处有一包含胸腺嘧啶-腺嘌呤-胞嘧啶-腺嘌呤-腺嘌呤（TACAA）框的启动子，提示D4Z4重复序列内可能存在功能性基因，由于该序列与双同源结构域蛋白家族序列相似，故被命名为“DUX4”。2007年，Clapp等发现DUX4基因的可读框在灵长动物基因进化过程中高度保守超过100万年，推测该基因可能编码功能蛋白，同时发现DUX4基因在睾丸和早期胚胎干细胞（ESCs）中呈正常表达，而在正常体细胞中不表达。同年，Kowaljow等在转染DUX4基因的小鼠肌母细胞C2C12、人横纹肌肉瘤细胞TE671和原代FSHD患者肌母细胞中检测到DUX4基因的mRNA产物，以及位于胞核、长度为50×103bp的蛋白质产物，并发现在C2C12和TE671细胞中过表达DUX4蛋白可通过激活Caspase3/7通路或改变细胞核膜Emerin蛋白的分布而诱导细胞凋亡。尽管D4Z4重复序列的主要转录产物来源于DUX4基因，但4q35的D4Z4重复序列最远端（近端粒端）的转录产物比其他D4Z4重复序列在3’非翻译区（3'UTR）多2个内含子，其转录可延伸至D4Z4重复序列远端的pLAM区，从而在DUX4基因转录产物上增加1个多腺苷酸化信号（PAS），这种现象仅见于致病性4qA单倍体型（4qA161），与特定4qA单倍体型的致病现象相吻合；此外，体外转录自pLAM区的多腺苷酸化信号可以稳定DUX4基因转录产物，与FSHD的发病密切相关，而缺乏多腺苷酸化信号的DUX4基因逆转录产物则不稳定。Lemmers等由此提出FSHD“统一遗传模型”，认为临床表型进展的重要因素包括两方面，一是4q35的D4Z4重复序列整倍缺失导致DUX4基因表观遗传去抑制，使肌细胞DUX4基因转录异常而致病；二是存在特定4qA单倍体型，使D4Z4重复序列最远端的DUX4基因转录产物增加1个多腺苷酸化信号，DUX4基因转录产物稳定，进而表达功能性DUX4蛋白而致病。根据“统一遗传模型”理论，大量研究聚焦于DUX4基因作为FSHD致病基因的分子机制探讨。Snider等采用巢式逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）分别检测FSHD患者和正常对照者的肌肉组织，以及经体外培养的原代肌肉干细胞中DUX4 mRNA表达变化，结果显示，所有携带4qA单倍体型受试者DUX4 mRNA表达均呈阳性，但无法区分患者与正常对照者；进一步的观察共发现3种DUX4基因转录本，其中两种可以产生全长DUX4蛋白，一种仅产生截短DUX4蛋白，全长DUX4蛋白来自患者，截短DUX4蛋白来自正常对照者，而且并非所有FSHD患者均表达全长DUX4蛋白。Jones等对FSHD患者及其一级正常亲属进行分析，发现正常对照者肌肉组织和肌母细胞中也存在DUX4蛋白及其全长转录产物，但其表达水平明显低于FSHD患者，因此认为全长DUX4蛋白唯有达到一定水平后方可能致病，提示影响全长DUX4蛋白表达及其功能的调节因子，包括家族遗传背景等也参与FSHD的发病。然而，无论是FSHD患者肌肉组织还是经体外培养的肌细胞，DUX4蛋白表达水平均较低，难以检出。Tassin等采用免疫组织化学染色或RT-PCR法检测FSHD患者来源的肌母细胞全长DUX4蛋白表达水平，仅有1/200-1/2000的肌母细胞表达全长DUX4蛋白。上述研究提示，单纯DUX4蛋白表达异常难以解释FSHD的发病机制，DUX4基因可能通过更为复杂的机制参与疾病的发生与发展。有关DUX4基因的作用机制尚不十分明确，目前主要倾向于两种机制，即全长DUX4蛋白对正常骨骼肌细胞的毒性作用；或全长DUX4蛋白作为多个基因的转录激活因子，导致部分对肌肉组织有毒性作用的蛋白过表达。DUX4蛋白的毒性作用最早见于转染DUX4基因的C2C12细胞，DUX4蛋白呈过表达的C2C12细胞凋亡率及其细胞周期凋亡标志物、细胞凋亡因子水平均明显升高；与此同时，由DUX4蛋白诱导的细胞凋亡还可见于FSHD患者肌肉组织，以及斑马鱼、果蝇、小鼠模型肌肉组织和其他组织中。采用小干扰RNA（siRNA）下调FSHD患者肌管细胞中全长DUX4蛋白表达，可降低细胞凋亡率。DUX4蛋白可通过激活Caspase3、上调p53相关基因和p21基因表达而诱导细胞凋亡。有研究显示，DUX4蛋白是多个基因的转录激活因子，这些基因在FSHD患者肌肉组织中的表达高于DUX4蛋白，绝大多数基因的转录产物均存在DUX4基因结合位点，提示DUX4蛋白可能通过影响其他基因的表达变化，参与FSHD的发病，同时也为部分患者肌肉组织DUX4蛋白水平较低仍可致病提供可能的解释。成对同源结构域转录因子1（PITX1）基因是首个被报道的DUX4靶基因，2007年Dixit等发现，FSHD患者肌肉组织DUX4基因和PITX1基因表达水平明显升高，其中PITX1蛋白水平是正常对照者的10-15倍；而且其体外实验还观察到，DUX4基因瞬时表达即可激活PITX1基因启动子并特异性与其中的顺式元件相互作用，上调PITX1基因表达，提示DUX4蛋白是PITX1基因的转录激活因子，DUX4基因转录产物通过激活PITX1基因而在FSHD的发病机制中发挥重要作用。通过基因芯片技术检测经体外培养的过表达DUX4基因的肌母细胞或FSHD患者肌母细胞mRNA，DUX4基因转录产物可上调或下调多条信号转导通路，包括Wnt介导的炎症反应通路、骨形态发生蛋白（BMP）介导的成肌分化通路、核因子NF-E2相关因子2（Nrf2）介导的氧化应激通路等，导致正常细胞功能失调，诱发FSHD。Tapscott团队通过RNA测序技术，观察DUX4蛋白作为多个基因的转录激活因子所致其他基因在FSHD患者肌肉组织中的表达变化，上述结果进一步支持DUX4基因在发病机制中发挥重要作用的学说。遗憾的是，目前构建的DUX4基因动物模型均未模拟出典型FSHD的临床症状。Wallace等以腺相关病毒6（AAV6）为载体，于模型小鼠胫骨前肌转染DUX4基因诱导DUX4蛋白过表达，1周后可见肌纤维损害和炎性细胞浸润现象，但模拟损害维持时间很短，3周后随着DUX4基因载体的消耗，其病理改变即恢复正常。Krom等构建的携带人4qA单倍体D4Z4重复序列的转基因小鼠模型，分别包含2.5个D4Z4拷贝数（D4Z4-2.5小鼠）和12.5个D4Z4拷贝数（D4Z4-12.5小鼠），小鼠出生后即在D4Z4-2.5小鼠生殖细胞和体细胞内检出DUX4-fl蛋白，并观察到与FSHD患者相似的D4Z4重复序列低甲基化的表观遗传学改变，但未见肌无力和肌萎缩症状，以及肌肉组织病理改变。另一项研究将多西环素诱导的DUX4转基因导入小鼠X染色体常染色质区，该基因长度为2.70×103bp，包含DUX4-fl基因可读框和4qA单倍体末端D4Z4重复序列3'UTR，可于构建的iDUX4（2.7）小鼠体细胞中检测到DUX4-fl基因转录产物，雄性携带小鼠仅存活2个月且出现皮肤和视网膜损害，而雌性携带小鼠症状很轻微，与D4Z4-2.5小鼠相比，iDUX4（2.7）小鼠则表现为肌无力和肌容积减小，但未见FSHD样症状。总之，DUX4基因表达异常是目前公认的FSHD的分子学发病机制，但具体作用机制尚未阐明，有待对相关动物模型做进一步探索。（2）FSHD1型其他候选致病基因的研究：1994年，Winokur等发现D4Z4重复序列位于4q近端粒异染色质内，进而提出“FSHD致病基因位置效应变异（PEV）”学说，即4q近端粒异染色质内D4Z4重复序列整倍缺失可导致该区域与常染色质区之间的缓冲带缩短，从而影响邻近基因的表达。这一学说引导了部分在D4Z4重复序列相邻区域寻找FSHD致病基因的研究。1996年，van Deutekom等首次提出FRG1基因可能是FSHD致病基因的观点，该基因定位于D4Z4重复序列上游近着丝粒端100×103bp处，编码一种高度保守的核蛋白，参与前信使RNA（pre-mRNA）的剪接。正常情况下，FRG1蛋白表达于包括骨骼肌在内的多种组织，在脊椎动物和无脊椎动物肌肉发育过程中发挥重要作用。但FRG1蛋白在FSHD患者与正常对照者肌肉组织中的表达差异尚存争议。2006年，Gabellini等构建FRG1转基因小鼠模型，其肌肉组织FRG1基因表达水平是正常小鼠的24-45倍。该项研究以及后续研究均显示，FRG1转基因小鼠可出现与FSHD表型相似的临床症状（如过表达FRG1基因诱导的肌膜完整、血清肌酸激酶正常的进行性肌营养不良症）和运动耐受能力下降，特定的肌纤维萎缩和肌球蛋白重链（MyHC）阳性细胞异常聚集，以及肌肉生长与再生障碍；且FRG1蛋白表达水平越高、小鼠肌无力症状越严重，提示高表达的FRG1蛋白引起的特定基因pre-mRNA异常剪接，可能是FSHD的发病机制。动物实验和体外研究观察到的FRG1转基因小鼠肌细胞存在Mtmr1和Tnnt3基因异常剪接的现象，同样与其他肌营养不良症的发病有关。其中，Tnnt3 mRNA异常剪接与FSHD的关系最为密切，FRG1转基因小鼠Tnnt3 mRNA异常剪接产生的异常蛋白异构体可损伤肌细胞的收缩特性，且该蛋白异构体对Ⅱ型肌纤维的影响较Ⅰ型肌纤维更加显著，这也与FSHD肌肉组织的病理改变相似，Tnnt3 mRNA异常剪接致蛋白变异越显著、临床表型越严重。另外，有研究显示FRG1蛋白可通过下调剪接因子Rbfox1蛋白的表达，引起钙蛋白酶3（calpain3）基因mRNA异常剪接发挥其致病性；而且过表达FRG1蛋白还可导致表观遗传调节因子Suv4-20H1蛋白出现更广泛的核分布，抑制肌母细胞分化。FAT1基因是FAT基因家族成员，定位于D4Z4重复序列近着丝粒端约3.30×106bp处，编码相对分子质量为506×103的跨膜蛋白，该蛋白与细胞迁移、抑制细胞增殖等有关。2013年，Caruso等发现FAT1蛋白缺失的小鼠呈现与FSHD相似的选择性肌肉受累的肌肉病表现和肌肉组织以外的症状，认为是FAT1蛋白通过调控肌母细胞迁移极性而影响肩带肌和面部肌肉的发育。他们还发现，FSHD1型患胎（流产的胎儿）肌肉组织FAT1蛋白和FAT1mRNA表达水平低于对照者（流产的非肌肉病胎儿），但成人FSHD1型患者肌肉组织FAT1蛋白表达水平与对照者无明显差异，且部分不携带D4Z4重复序列整倍缺失的FSHD患者存在FAT1基因或其调节区基因突变，表明FAT1蛋白表达下调或者缺失可能与FSHD发病有关。在Puppo等观察的49例日本FSHD病例中，无一例出现4q35区域D4Z4重复序列缺失、低甲基化和SMCHD1基因突变，但有10例患者存在FAT1基因致病突变，提示FAT1基因可能与FSHD的发病有关。然而，Mariot等认为，FSHD早期受累肌肉FAT1基因表达水平低于晚期受累肌肉，成年患者肌肉组织FAT1基因表达水平低于正常对照者，但FAT1基因表达变化与DUX4蛋白无关联性，所得结果与Caruso等的不尽一致。Park等于2018年报告1例FSHD1型患者的基因分析结果，提示存在FAT1基因突变，该基因可能为FSHD的修饰基因。目前关于FAT1基因与FSHD关系的研究较少，尚无法提供更多的实验证据。尽管有学者也对FRG2、ANT1和DUX4C基因与FSHD发病的关系进行探讨，但这3个基因的动物模型均未出现FSHD样肌无力和肌萎缩症状，故其作为FSHD1型候选致病基因的可能性较小。 3. 表观遗传学研究 FSHD1型和FSHD2型患者均存在D4Z4重复序列CpG岛低甲基化，以及组蛋白抑制性修饰缺失的表观遗传学改变，例如组蛋白H3赖氨酸9三甲基化（H3K9me3）缺失，表明表观遗传学与FSHD的发病机制有关。据研究显示，4q35区域D4Z4重复序列可能存在异染色质的沉默，该序列的缩短与局部染色体序列去抑制引起的基因异常表达有关；缩短的D4Z4重复序列可能通过多个表观遗传因子影响组蛋白修饰、位置效应变异、DNA甲基化，导致局部异染色质结构开放，从而表达异常蛋白。Gabellini等在D4Z4重复序列中发现一由27个碱基对组成的区域即D4Z4结合元件（DBE），D4Z4结合元件可以募集数个与组蛋白表达相关的调节因子如YY1/HMGB2/nucleolin组成的蛋白复合体，该复合体通过结合D4Z4重复序列以调节4q35区域基因的转录抑制，D4Z4拷贝数越少、转录抑制作用越弱。Bodega等的研究也进一步证实上述结论，同时还发现另一个D4Z4结合元件。CabiancaDaphne等认为，4q35区域的基因表达可能受多梳抑制复合体（PRC）的调节，该复合体与p13E-11区域和D4Z4重复序列的多个位点结合，通过下调多梳抑制复合体的表达以减轻上述结合区域的抑制状态，他们提出一种模型，即FSHD患者4q35区域D4Z4拷贝数减少致多梳抑制复合体结合位点减少，从而在D4Z4结合元件区域产生一种较长的非编码RNA——DBE-T，DBE-T通过募集相关蛋白而影响4q35区域的基因表达。DNA5’端胞嘧啶甲基化是一种常见的DNA修饰，与染色质和表观遗传沉默有关。D4Z4重复序列异常甲基化也参与FSHD的发病，每个D4Z4重复序列包含1个CpG岛，正常人脑组织、肝脏和肌肉组织中的D4Z4重复序列CpG岛均呈高度甲基化，提示D4Z4重复序列表达抑制，而睾丸组织D4Z4重复序列CpG岛呈低甲基化，与正常人睾丸组织D4Z4重复序列相一致。vanOverveld等采用甲基化敏感的限制酶切法证实了FSHD1型患者4q35区域D4Z4重复序列的甲基化程度低于正常对照者，同时发现有FSHD临床表现但无4q35区域D4Z4重复序列整倍缺失的患者也存在D4Z4重复序列低甲基化，提示D4Z4重复序列低甲基化可能与FSHD的发病有关。进一步研究显示，D4Z4拷贝数少、病情严重的患者，其D4Z4重复序列甲基化程度较低。Lemmers等发现，D4Z4重复序列甲基化程度与其拷贝数不成比例，D4Z4拷贝数小于阈值（<7个）时，其甲基化程度显著降低。Huichalaf等采用亚硫酸氢盐测序法对D4Z4重复序列及其更大延伸区域的所有CpG岛位点甲基化程度进行检测，发现不同4q35区域的甲基化程度各异，近端粒端的甲基化程度高于近着丝粒端，由此认为，D4Z4重复序列甲基化程度与疾病严重程度具有相关性。Jones等采用同样的检测方法亦发现FSHD患者的4qA单倍体近端粒端D4Z4重复序列甲基化程度低于正常对照者。 4. FSHD2型发病机制研究 FSHD1型与FSHD2型临床表现相似，单纯依靠临床表现难以进行鉴别。与FSHD1型不同的是，大多数FSHD2型为新发突变，FSHD1型呈常染色体完全显性遗传，FSHD2型遗传方式复杂，有家族史的家系既可呈显性亦可呈隐性遗传。FSHD2型无4q35区域D4Z4重复序列的整倍缺失，其D4Z4重复序列长度与病情严重程度无关，但是FSHD2型患者存在至少1条特定4qA单倍体型。FSHD1型和FSHD2型均存在特定染色体区域的低甲基化和组蛋白修饰改变，不同的是，FSHD1型的表观遗传学改变仅发生在4q的D4Z4重复序列，而高度同源的10q的D4Z4重复序列无改变；FSHD2型的表观遗传学改变则同时发生在4q和10q的D4Z4重复序列。2012年，Lemmers等对19个无血缘关系的FSHD2型家系进行全外显子组测序（WES），其中15/19个家系携带第18号染色体的SMCHD1基因杂合致病突变，这些患者肌细胞SMCHD1蛋白水平低于正常对照者，该蛋白表达降低程度与D4Z4重复序列低甲基化程度相一致，此外，同时携带SMCHD1基因突变和4qA单倍体型的患者可在其肌肉组织中检出DUX4-fl蛋白表达异常，由于D4Z4重复序列存在SMCHD1蛋白结合位点，而FSHD2型患者该位点缺失且部分敲除该基因后则可出现D4Z4重复序列去抑制，因此他们首次提出SMCHD1基因是D4Z4重复序列的表观调节因子的学说，即FSHD2型的致病基因。一项大样本FSHD2型家系研究结果显示，约85%的患者存在SMCHD1基因突变，且突变类型及其所在基因位点不同、D4Z4重复序列甲基化程度不同，病情严重程度也有所不同；少数FSHD2型患者与第20号染色体DNMT3B基因突变有关，DNMT3B基因突变同样可出现D4Z4重复序列低甲基化，并导致同时携带4qA单倍体型的患者出现FSHD样表现。 三、治疗研究目前，FSHD尚无根治方法。低强度的有氧运动可以提高肌力和改善生活质量，尽管多项临床试验对糖皮质激素，钙通道阻断药地尔硫、沙丁胺醇，氧化应激抑制剂维生素C、维生素E、硒代甲硫氨酸、锌剂，肌肉生长抑制素（myostatin）抑制剂等药物疗效进行研究，但至今尚未取得有效成果。近年，随着FSHD分子机制的研究进展，分子治疗开始关注DUX4-fl蛋白和FRG1蛋白功能抑制与清除。 DUX4基因是目前最有可能的FSHD致病基因，针对其治疗策略成为研究热点。通过siRNA清除DUX4基因的尝试首先在经体外培养的FSHD肌母细胞中进行，Lim等设计了一系列靶向D4Z4重复序列的DUX4基因编码区、3’非编码区（3'NCR）和DUX4基因启动子的siRNA，动物实验结果显示，靶向DUX4基因编码区和DUX4基因启动子的siRNA可以有效降低DUX4基因及其靶基因表达水平，靶向DUX4基因启动子的siRNA可以提高局部区域的甲基化程度，提示siRNA可以改变表观遗传沉默的DUX4基因。Wallace等于小鼠胫骨前肌局部肌肉注射以AAV6为载体的过表达DUX4-fl基因和靶向DUX4-fl基因的AAV6siRNA，证实siRNA在体内沉默DUX4-fl基因的表达是可行的，同时可以改善小鼠DUX4-fl蛋白导致的肌肉组织病理改变。 此外，采用反义寡核苷酸（ASO）如吗啉寡核苷酸（MOS）和磷酸二酰胺吗啉低聚物（PMO），可在空间上阻止翻译或干扰靶RNA剪接以抑制DUX4基因表达。将针对DUX4基因pre-mRNA的多腺苷酸化信号位点的MOS作用于FSHD肌管细胞，可显著下调DUX4基因下游的DUX4蛋白靶基因表达，表明ASO能够有效沉默DUX4-fl蛋白；或将成簇的规律间隔的短回文重复序列（CRISPR）/dCas9系统作用于FSHD肌母细胞DUX4基因启动子，同样可以抑制DUX4-fl蛋白及其下游DUX4蛋白靶基因表达。总之，目前有多种方法可以抑制DUX4-fl蛋白的表达，但大多处于体外实验阶段，期待尽早获得令人鼓舞结果。 FRG1基因在FSHD患者肌肉组织中呈异常高表达。在FRG1转基因小鼠模型中，通过靶向FRG1基因的siRNA或短发卡RNA（shRNA）抑制FRG1基因功能，可以显著增强小鼠肌力和肌容积、减轻肌肉组织病理损害；通过上调FRG1蛋白抑制剂FHL1蛋白表达以抵消FRG1蛋白的作用，过表达FHL1蛋白同样可以改善小鼠肌肉组织病理损害，增加肌容积。 四、国内分子诊断研究历程1955年，北京协和医院谭铭勋对33例进行性肌营养不良症患者的临床特点进行了详细分析，其中8例为FSHD，此为国内首次系统报道肌营养不良症的临床研究。1983年，四川医学院附属医院（现为四川大学华西医院）徐文桢等报告一家系共19例患者，均呈常染色体显性遗传。2001年，中山大学附属第一医院曾缨和张成成功采用基于EcoR I+Bln I双酶切基因组DNA琼脂糖凝胶电泳联合p13E-11探针的Southern blotting法对我国FSHD患者进行基因诊断和症状前诊断，此为国内开展的首例基因诊断试验；2002年，中山大学附属第一医院张成教授与日本国家神经科学研究所、Toneyama国立医院、东京医科大学和韩国大田生物医学株式会社合作，通过Bgl II-Bln I剂量检测方法对114名健康中国人、153名健康日本人、124名健康韩国人和56例日本FSHD患者的4q与10q易位情况进行检测，结果显示，4q与10q易位发生率与种族无关，而且4q易位至10q的发生率高于10q易位至4q。次年，中山大学附属第一医院苏全喜等和福建医科大学附属第一医院王柠等以同样方法在我国FSHD患者和正常人群中成功检测到4q35与10q26易位，发现中国人群4q35和10q26易位发生率与国外相近。同年，福建医科大学附属第一医院王志强等通过基于脉冲场凝胶电泳的Southern blotting法对我国FSHD患者进行基因诊断，结果发现易位、杂合、体细胞嵌合等复杂现象。2006年，福建医科大学陈中杰采用基于脉冲场凝胶电泳联合4qA/4qB探针的Southern blotting法，对我国FSHD患者4q35-ter区域等位基因4qA和4qB结构特征进行探讨，为第4号染色体单倍体的分布提供了较为翔实的数据。自此，我国FSHD分子诊断技术不断进步，由于基于脉冲场凝胶电泳或琼脂糖凝胶电泳的Southern blotting技术操作难度较大、放射性污染较为严重，国内学者开始致力于开发并推广更加简便易行的分子诊断方法。2007年，中山大学附属第一医院李婉仪建立了可快速诊断FSHD的实时荧光定量PCR技术，其准确性和敏感性与传统Southern blotting法相近，但较好地解决了耗时、费力、放射性污染等问题，同时能够检出4q35与10q26易位、探针结合部位缺失等非典型患者。此后，福建医科大学附属第一医院苏全喜等进一步对实时荧光定量PCR技术的反应条件进行改进，使其检测准确性有所提高。至2018年，广州嘉检医学有限公司张巍、中山大学附属第一医院张成以及复旦大学附属华山医院朱雯华等首次采用分子梳技术诊断FSHD并获得成功，与传统检测方法相比较，分子梳技术更加简便、易行，适于临床推广应用。 五、总结与展望FSHD既往被认为是简单的、临床表型特异的常染色体显性遗传性肌肉病，随着近年分子遗传学、表观遗传学、细胞水平研究技术的不断提高与进步，已证实FSHD是具有较为复杂分子遗传学机制的肌肉病。基于脉冲场凝胶电泳或琼脂糖凝胶电泳的Southern blotting技术是目前诊断FSHD的“金标准”，新近发展的分子梳技术简便、实用，易于在临床推广应用。DUX4基因异常表达是目前较为公认的分子学机制，但其发病机制和动物模型尚待进一步研究。随着FSHD分子学机制的进展，必将出现新的治疗方法。 综上所述，尽管FSHD在发病机制、诊断方法已取得长足进步，但仍有诸多问题亟待解决，其治疗方法亦需更多的深入研究。我国已经成立了FSHD病友会和专家协作组，通过了解疾病历史和现状，找出突破点，在政府相关部门、临床专家和病友们的共同努力下，有望促进我国FSHD研究的发展。
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