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来源：小桔灯网 作者：动力彩虹 用于识别病原体和测量抗生素敏感性的诊断工具在控制传染病方面发挥着关键作用。在血液感染（BSI）的情况下，快速诊断时间表至关重要，因为患者在感染中存活的几率与症状出现和服用适当抗菌剂之间的时间长短成反比。不幸的是，大多数诊断实验室需要2-5天才能完成微生物鉴定（ID）和抗菌药物敏感性测试（AST）。一种更有效的完成ID和AST的方法每年可以挽救数万人的生命，减少住院时间，并降低平均治疗成本。此外，诊断时间长有助于选择抗药性微生物，因为治疗BSI的时间敏感性迫使临床医生在几乎没有或没有实验室数据的情况下做出治疗决定。 尽管快速的基于分子的诊断工具正在出现，但由于既需要识别生物体，又需要根据经验确定其抗药性特征，这些工具中的许多无法整合到工作诊断实验室中。代谢组学为加速诊断提供了独特的机会，同时符合临床实践中使用的既定工作流程。分泌代谢物的含量可能是单个蛋白质的数千倍，是微生物生理学的敏感reporter，并且与已建立的高通量临床质谱平台兼容。因此，基于敏感代谢物的分析有可能最小化现有临床工作流程中的限速步骤。 近日，来自加拿大的研究团队在Nature Communications上发表了一篇题为“Metabolic preference assay for rapid diagnosis of bloodstream infections”的文章，在文章中，研究团队介绍了一种诊断策略，即代谢偏好分析（MPA），它使用体外微生物培养物的消耗代谢产物与排泄代谢产物的模式来识别病原体并测量其抗菌敏感性。研究团队确定了能够区分七种最常见的BSI病原体（白色念珠菌（CA）、肺炎克雷伯菌（KP）、大肠杆菌（EC）、铜绿假单胞菌（PA）、金黄色葡萄球菌（SA）、粪肠球菌（EF）和肺炎链球菌（SP））的生物标记物，表明使用代谢抑制试验（MIA）的代谢物水平变化可以经验性地测量抗菌素的活性，并证明在与诊断实验室使用的领先平台（VITEK 2，BioMérieux）的竞争中，MPA将测试时间从40小时缩短到20小时以下。如果付诸实践，这种检测可以降低感染性休克死亡率，减少广谱抗生素的使用。  图片来源：Nature Communications 主要内容 七种代谢物可以区分导致BSI的物种。 尽管几乎所有生物体都有中心碳代谢的核心结构，但这些代谢途径活动因遗传和环境因素而异。因此，通过严格控制环境变量，代谢途径活动可作为微生物种类的指标。这一基本假设是基于MPA的诊断方法的基础，可以通过在良好控制的条件下量化临床相关微生物的代谢边界通量（营养物质和废物消耗或产生的速率）来验证。为了验证这一点，研究团队测量了七种最常见的血流病原体的代谢边界通量。 数据集中物种依赖性消耗或产生210个潜在标志物的有力地区分了七个目标物种（图2a）。尽管密切相关的微生物（如肺炎克雷伯菌和大肠杆菌）之间标记物的总体模式相似，但观察到的代谢模式具有物种特异性。值得注意的是，只有七种生产生物标记物足以区分目标病原体，并在发现数据集中作为每个物种的二元预测因子（图2b）。具体而言，阿拉伯糖醇、黄嘌呤和N 1、N 12-二乙酰精胺分别由白色念珠菌、铜绿假单胞菌和粪大肠杆菌单独产生。肺炎克雷伯菌和大肠杆菌都产生琥珀酸，但后者不产生尿苷酸。甲羟戊酸是由金黄色葡萄球菌产生的，粪肠球菌的产生程度较小，但与粪肠球菌不同，金黄色葡萄球菌不产生N 1，N 12-二乙酰精胺。乳酸是由肺炎链球菌产生的，在较小程度上是由粪肠球菌产生的。  七种常见血液感染病原体的代谢偏好分析（MPA）。 图片来源：Nature Communications 评估七种候选生物标记物的诊断稳健性 为了评估七种候选生物标记物的诊断稳健性，研究团队在一个独立的验证队列中量化了从血液感染中收集的596株临床分离株中每种代谢物的水平。通过MPA分析在这些菌株中观察到的代谢表型，并重新评估发现数据集中确定的210个特征。验证数据集显示，210个标记中有203个标记存在显著差异。此外，为区分物种而优先选择的七种代谢物遵循了在发现数据集中观察到的相同物种特异性图谱（图2c），这些差异非常显著。在确定的203个重要生物标志物中，没有一个与患者年龄或性别显著相关。总之，两个独立的样本队列证明，代谢谱可以有力地区分物种，选择一组七种代谢物就足以识别常见的BSI病原体。 这些数据表明，微生物培养物中代谢物的变化模式可以作为识别血液病原体的有力诊断工具。  验证集--七种常见血液感染病原体的代谢偏好分析（MPA）。图片来源：Nature Communications 通过代谢抑制试验快速进行抗生素敏感性检测。 将代谢组学用于微生物诊断的一个主要优点是，代谢是细胞生理学的敏感报告者。营养前体转化为废物的速度比微生物的生长速度快很多个数量级。当细胞暴露于有毒物质时，这些过程会显著改变或完全停止。因此，代谢组学方法提供了一个独特的机会，可以在当前基于生长的AST方法所需时间的一小部分时间内对抗生素敏感性进行经验性评估。在此，研究团队评估了使用基于MPA的代谢抑制试验（MIA）作为量化抗生素敏感性的诊断平台的实用性。 MIA是通过在有无抗菌剂的4h潜伏期后监测微生物培养上清液代谢成分的变化来完成的。为了评估MIA作为一种潜在的临床工具，对每种目标病原体的三个患者分离株进行了分析。抗真菌药物（唑类、多烯类和抗代谢药物）对白色念珠菌进行了测试。对杀菌（青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类、糖肽类、氨基糖苷类、氟喹诺酮类和甲氧苄啶磺胺甲恶唑）和抑菌（大环内酯类和四环素类）抗生素进行了评估。MIA测定的抗菌药物敏感性曲线与传统微生物生长分析中观察到的98%曲线一致。所有抗菌剂作用机制的分析结果一致在大多数情况下，用于识别微生物的生物标记物也有助于区分药物敏感和耐药菌株（例如，白色念珠菌的阿糖醇、肺炎克雷伯菌和大肠杆菌的琥珀酸、粪大肠杆菌的N 1、N 12-二乙酰精胺、绿脓杆菌的黄嘌呤和肺炎链球菌的乳酸）。总的来说，这些数据表明，MIA策略可以作为抗生素耐药谱的指标。  代谢抑制试验（MIA）用于评估抗生素敏感性。 图片来源：Nature Communications 使用快速LC-MS方法对代谢抑制试验进行性能验证。 为了进一步评估MIA的表现，研究团队使用具有不同抗生素敏感性特征的更大的菌株队列（n=246）评估了该工作流程。该队列包括大肠杆菌（n=50）、金黄色葡萄球菌（n=63）、肺炎克雷伯菌（n=35）、肺炎链球菌（n=49）、粪肠球菌（n=23）和屎肠球菌（n=24）。研究团队发现葡萄糖消耗是金黄色葡萄球菌和肠球菌对抗生素敏感性的最可靠指标；琥珀酸产生是检测大肠杆菌和肺炎克雷伯菌敏感性的最可靠指标；烟酸的产生是肺炎链球菌敏感性最可靠的指标。 抗生素诱导的代谢物消耗抑制（MIAc）和代谢物产生抑制（MIAp）是使用在Mueller-Hinton培养基中培养4h的培养物的代谢物强度计算的。使用从训练集计算的MIAc和MIAp阈值，研究团队预测了由166株临床分离菌组成的测试集的抗生素敏感性。研究团队观察到MIA分析与VITEK 2平台产生的结果之间有95.2%的一致性，物种特异性预测范围从肺炎克雷伯菌的90.3%到金黄色葡萄球菌的97.6%。重要的是，主要错误率（对VITEK 2敏感，对MIA耐药）为3.1%，而非常严重的错误率（对VITEK 2耐药，对MIA敏感）仅为1.7%。总的来说，这些数据表明MIA是抗菌药物耐药性分析的一个可靠的指标。  区分敏感菌株和耐药菌株的计算代谢抑制阈值。 图片来源：Nature Communications 基于代谢的诊断可将病原体ID和AST时限缩短20小时以上。 该项目的主要动机之一是迫切需要快速诊断血流感染的工具。为了评估通过MPA/MIA诊断工作流程可以节省的潜在时间，研究团队在MPA/MIA和bioMéieux VITEK 2平台之间进行了三次独立的（n=3）正面竞争。结果显示，MPA/MIA工作流程将金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的总检测时间分别平均减少24.3小时和22.4小时，分别相当于总检测时间减少了2.2倍和2.3倍。对于金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，仅在血瓶标记后进行菌株鉴定和抗生素敏感性检测所需的时间就分别减少了4.7倍和5.0倍。  VITEK2测试平台与基于代谢组学的诊断时间表。 图片来源：Nature Communications 总结与讨论 这里介绍的MPA/MIA诊断工作流作为临床诊断平台有许多优点。除了在感染类型方面具有固有的灵活性外，它还可以将ID和AST测试集成到单个仪器上。此外，MPA/MIA工作流程需要最少的样本处理，允许直接从血瓶中采集样本，并且不需要对分离株进行继代培养。此外，已经有商用质谱仪被认证为医疗设备（如Thermo Fisher Altis），可以简化MPA/MIA向临床实践的过渡。总之，MPA/MIA工作流程为微生物培养物的鉴定和分型提供了一种令人兴奋的策略，并可能为未来的临床诊断提供一条途径。 代谢组学工作流程提供了符合当前临床实践要求的微生物特性和经验性确定的敏感性曲线。此外，质谱的高灵敏度，以及相对于细胞或大分子的高丰度代谢物，使MPA/MIA工作流程天生适合快速诊断。总之，研究团队证明，这种体外代谢组学工作流程可以（i）准确识别最常见的血流病原体，（ii）以高精度经验性确定抗生素敏感性曲线，以及（iii）将血流感染的诊断检测时间缩短20小时以上。如果付诸实践，这种检测可以降低感染性休克死亡率，减少广谱抗生素的使用。 |
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