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2018年FDA批准NTRK基因融合的靶向药物来罗替尼（larotrectinib）上市。临床试验包括了17个癌种的55例泛癌种患者，如黑色素瘤、胆管癌、分泌性乳腺癌等，用药有效率高达75%，这就充分说明了检测NTRK基因的重要性。 NRTK融合在成人疾病中多出现在涎腺肿瘤、分泌性乳腺癌等；而在儿童身上多发生在先天性中胚层肾瘤、婴儿纤维肉瘤等。这些癌种的发生率高达25%以上，而在肺癌、胆管癌、结直肠癌等发生率很低，低于5%甚至1%。2020年的一篇报道，用NGS技术，共检测26000例肿瘤患者，其中有74例出现NTRK融合，比例为0.28%。NTRK的检测方法比较也可见于我司原来发表的微文“NTRK1/2/3检测：靶向用药，诊断先行”。 神经营养因子受体酪氨酸激酶NTRK（NeuroTrophin Receptor Kinase）家族包括由 NTRK1、NTRK2 和 NTRK3 基因，它们分别编码原肌凝蛋白受体激酶(TRK)蛋白TRKA、TRKB和TRKC三种蛋白，这些蛋白通常在神经组织中表达。这三个基因虽然在不同染色体上，但是结构类似，而且发挥着相似的生物学功能。它们的酪氨酸激酶结构域都位于NTRK基因的3’端，伙伴基因与NTRK基因发生融合后，TRK融合蛋白将处于持续活跃状态，引发信号级联反应，从而驱动促进TRK融合肿瘤的扩散和生长。 介绍完这些背景后，濮老师对NTRK基因做了一个小结： 1），NTRK的断裂位置并不是唯一的，很多不同的断裂位置，不一定都发生在酪氨酸激酶结构区，但是都包括了酪氨酸激酶结构区；2），NTRK融合倾向于发生在无其他驱动基因变异的癌种中。 目前检测NTRK融合基因的主流方法包括：免疫组化中检测Pan-trk抗体，FISH方法和NGS方法。2017年有文献指出IHC方法检测比较有效：23例NGS阳性病例用IHC检出20例阳性，3例阴性。
而2021年的另一篇文章中，作者认为IHC方法检测NTRK特异性并不高。作者对494例间叶性肿瘤患者进行了免疫组化的检测，其中有16例阳性。这些患者进一步行NGS检测，但仅有5例为阳性。基于这个结果，作者并不推荐使用IHC方法进行NTRK检测。
由于不同的研究对于IHC检测NTRK的有效性存在争议，目前对于NTRK融合肿瘤筛选策略如下图：NGS或FISH方法如果阳性，则可直接进入治疗；而IHC方法阳性则建议进一步行NGS检测。
虽然在很多文章中显示FISH与NGS的结果一致性要远远高于IHC与NGS的一致性，但是FISH检测也有一个缺陷，就是只能检测是否发生融合但不能识别具体断裂位置，从而不能知道融合嵌合体的构成情况，导致不能区分有效融合。而在结直肠癌中，FISH联合错配修复蛋白IHC检测是筛选经典型融合的有效办法（见下图）。
最后一部分，濮老师对FISH检测NTRK的判读陷阱，结合案例进行了指导。 1）NTRK断裂探针信号遇到单红或者单绿的情况：NTRK1、NTRK2基因都是从左向右转录，5’在左边，3’在右边。NTRK3基因是从右向左转录，5’在右边，3’在左边。而安必平的NTRK1断裂探针、NTRK2断裂探针和NTRK3断裂探针都是左边标记红色，右边标记绿色。NTRK基因是靠3’端带有酪氨酸激酶区域的片段与伙伴基因发生融合，融合后导致TRK融合蛋白处于持续活跃状态，引发信号级联反应，从而驱动促进TRK融合肿瘤的扩散和生长。而酪氨酸激酶区域所表达的氨基酸段是larotrectinib的靶向区域，TRK融合蛋白含有酪氨酸激酶区域的氨基酸段，用药才有效，否则无效。 所以 NTRK1、NTRK2的3’端（右端）为绿色，出现1绿1黄时为不典型阳性（因为靠近3’端的酪氨酸激酶区域还存在）；而出现1红1黄时为阴性（因为靠近3’端酪氨酸激酶区域的绿色区段缺失了，融合基因不表达酪氨酸激酶结构域，药物无效）。而NTRK3断裂探针因为红绿端位置与NTRK1、NTRK2相同，但其5’和3’恰好反过来，所以情况与NTRK1/2恰好相反，1红1黄为不典型阳性，1绿1黄为阴性。 2）NTRK断裂探针显示分离信号是否一定为阳性：濮老师针对断裂探针中出现的各种不典型异常信号，从DNA层面做了原因分析(见下图)。
由图可知DNA重排方式的复杂性是导致FISH信号类型多样的主要原因，也是导致FISH阳性而NGS检测阴性的主要原因。 而RNA层面上，转录中“通读事件”导致重排/融合并不涉及到DNA层面，无法通过FISH DNA检测进行分析，这也是FISH阴性但NGS阳性的主要原因。 3）融合探针未显示融合信号是否一定为阴性：濮老师用了安必平公司的一个病例做分析，该例样本在形态上比较像涎腺分泌性癌，送安必平检验所做了ETV6-NTRK3融合探针，并没有看到融合信号，但是有大量的3红两绿的信号。而红色标记的是ETV6基因，这种3红的表现很可能是出现了ETV6断裂，但是并没有与NTRK3融合，而是与第三方基因发生了融合，所以就进一步做了ETV6的易位检测，结果的确是ETV6发生了断裂。得出结论：融合探针阴性，但是出现了特殊信号，可以尝试用断裂探针进一步验证。 4）纤维肉瘤中ETV6断裂探针阴性是否代表没有NTRK基因融合：用到文献上的一个案例，患者为先天性婴儿纤维肉瘤，做了NTRK3-ETV6融合为阴性，但是通过NGS检测，发现该患者是出现了EML4-NTRK3融合，得出结论：由于重排伴侣的多样性和不确定性，可以尝试多种断裂探针进行诊断。 最后濮老师对整个讲座做了重点信息的总结：1，IHC与NGS的一致性不同的研究结果不一致，与FISH的一致性研究报道较少。2，FISH可联合其它检测来预测经典型NTRK融合的发生（如结直肠癌中可以联合MSI状态检测），从而准确指导用药。3，只有生成有效的融合转录本或有效的融合蛋白才是靶向用药的标准，鉴于FISH无法提供具体的断点信息，用药指导不推荐FISH作为最终诊断。4，RNA-based NGS在检测融合上灵敏度优于DNA-based NGS，且可以明确断点信息，预测有效转录本，是用药指导的首选检测方法。5，对于疾病的辅助诊断，FISH是最方便快捷的检测方法。 大家也对课程内容进行了热烈讨论。比如： 提问1：RNA NGS是否能用石蜡包埋组织标本？ 濮老师说：虽然可以，但是NGS对标本的要求较高，如果出现一些基因的碎片化，结果可能不准确。 提问2：FISH判读的阈值为多少？ 濮老师说：综合多篇文献，该基因断裂的阈值定为15%；但是如果计数在10-15%之间，要换人再重新计数，经过双人判读验证或其他方法的验证。而且经验之谈，很少遇到阈值临界的，阳性通常比较明显。 提问3：是否会用快速石蜡标本进行FISH试验？ 濮老师表示没做过这种类型的标本，可能信号未必会好。 提问4：纤维肉瘤里FISH的敏感性如何？ 这实际上是间叶肿瘤中检测NTRK的阳性率的问题。有研究指出，在婴幼儿或年轻成人躯体或皮下间叶性肿瘤中，如果组织学表现为炎性肌纤维母细胞性肿瘤类型、或纤维肉瘤样或恶性外周神经鞘膜瘤样类型、或脂肪纤维瘤病样类型，IHC常共表达CD34及S100、但SOX10常为阴性，这些组织学及IHC特征往往NTRK的阳性率较高。 一个半小时的讲座就在热烈的学习氛围中结束了。濮老师在课程中说了一句话：用扎实的理论知识和严谨的事实推导才能还原基因世界的黑匣子。这句话充分表现了濮老师对于学术研究严谨及踏实的精神。这次课程的深度也给大家带来了不少启发，课件中的案例及经验分享相信也能帮助到大家对NTRK检测的实际运用。 讲座回放已上架，期待大家上爱病理平台学习及重温。
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