|
蛋白质互作研究按照实验目的可分为两大类，一是筛选某个兴趣蛋白的互作蛋白；二是验证两个蛋白是否存在相互作用及抑制剂or激动剂筛选。 筛选某兴趣蛋白的互作蛋白 传统检测 1 免疫共沉淀（CoIP） 以抗体和抗原之间的特异免疫反应为基础，是研究蛋白质互作的经典方法。 基本原理：在细胞裂解液中加入抗原特异的抗体进行孵育，若裂解中有和抗原互作的蛋白，则会形成“抗体-抗原-抗原互作蛋白”的免疫复合物，该免疫复合物经纯化、洗脱、收集，即可用于SDS-PAGE，western blot及质谱分析，进而鉴定出与抗原有互作的蛋白质。
2 Pull down技术 基本原理：将一种蛋白质固定于某种基质上（如Sepharose），但细胞抽提液经过该基质时，可与该固定蛋白相互作用的配体蛋白被吸附，而没有被吸附的“杂质”则随洗脱液流出。被吸附的蛋白可以通过改变洗脱液或洗脱条件而回收下来。通过pull down技术可以确定已知的蛋白与钓出蛋白或已纯化的相关蛋白间的相互作用关系，从体外转录或翻译体系中检测出蛋白相互作用关系。 总结：Co-IP证明两个蛋白在胞内有相互作用，但是这个作用可以是直接相互作用，也可以是形成复合物后的间接相互作用。pull-down是胞外纯化蛋白后证明两个蛋白之间有相互作用，这个相互作用必然是直接相互作用。亚细胞组分的全谱分析，IP、co-IP、Pull-down后的互作蛋白鉴定，或其他中等复杂蛋白样本的鉴定，通常要结合液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）技术进行蛋白分析！
相关产品
3 新兴技术--邻近标记技术 APEX或BioID等在活细胞中进行邻近标记（生物素标记），可用来确定蛋白质-蛋白质相互作用和蛋白质亚细胞定位。优势：假阳性率低，而且使针对弱的蛋白间相互作用和瞬时蛋白相互作用的检测成为可能。 传统方法应用（链霉）亲和素微珠纯化生物素化的蛋白质并进行LC-MS / MS分析。新兴方法侧重于鉴定生物素化的肽，CST的PTMScan® Anti-Biotin Kit #41343所用单克隆抗体的稳定性、特异性和无偏性好。针对肽段水平的富集，结合CST科学家对整体实验方案的优化，能明显提高邻近标记技术鉴定后的肽段检出水平，更好的服务于蛋白互作和亚细胞结构定位等的实验目的。 验证蛋白间相互作用及药物筛选 均相发光检测体系 1 HTRF技术 PerkinElmer的Alpha技术结合Cisbio（现已被PerkinElmer收购）的HTRF技术，提供全套均相体系的高通量筛选平台（Homogeneous Assay) ，均相免洗体系，实现药物研发早期高效筛选待测药物，以及药物研发后期药物功能性评价！AlphaScreen和HTRF技术已成为各大药企和CRO药物研发必备平台！
HTRF技术已应用众多蛋白互作研究模型，使用成本低，并深受广大科学家喜爱，HTRF技术提供tool box可以开发您想研究的实验模型！ But~如果您研究的蛋白互作，结合力较弱，推荐您选择检测灵敏度更高的Alpha技术，提高实验窗口！ 2 Alpha技术 Alpha技术是一种基于微珠的高灵敏度均相 (Mix & Measure) 检测技术。 Amplified：放大 Luminescence：化学发光 Proximity：接近 Homogeneous：均相 Assay：检测 原理：Alpha技术使用供体和受体两种微珠，结合于供体微珠上的分子（分子 A）与结合于受体微珠上的分子（分子 B）发生相互作用，当两个微珠达到足够接近的状态时，能够检测出发光信号。供体微珠表面的光敏剂经激光照射而受到激发，将周围的氧转变为激发态的单线态氧。单线态氧向供体微珠周围扩散，到达附近的受体微珠后可在微珠内引发化学发光反应，并最终发射出光。如果加入的化合物抑制剂可以抑制微珠上的分子 A 与分子 B 的相互作用，则供体微珠产生的单线态氧不会到达受体微珠，从而不会引发化学发光反应。
均相检测优势 ★ 均相 (Mix & Measure)：无需分离和洗涤步骤，操作简便。 ★ 非常适合生物分子的相互作用 ：单线态氧的扩散距离可达到 200 nm，最大程度减少了供体/受体之间的 距离和方向限制。因此可用于全长蛋白检测和使用抗体的夹心免疫测定等应用。 ★ 具有较宽范围的亲和性：可检测亚 nM ~ µM（低亲和性）范围的相互作用。低背景、高灵敏度：通过激发光照射进行检测的方法会受到样品和微孔板生成的自发荧光的影响，产生较高的背景。Alpha技术中，与单线态氧发生反应的受体微珠的发光时间较长（半衰期：300毫秒）， 因此可在激发光照射完一段时间后（20毫秒后）再开始检测，从而有效避免自发荧光的影响。此外，检测波长比激发波长更短，而自发荧光的波长比激发波长更长，因此自发荧光的影响也会进一步降低。 ★ 可实现自动化：由于微珠的体积非常小（直径 250 nm）且不易发生沉淀，因此不会堵塞分液头，易于实现自动化分液操作，非常适合HTS。
PerkinElmer可提供Tool box开发蛋白互作研究模型 相关产品 ● 直接标记检测 HTRF技术和Alpha技术均可以提供定制标记服务或标记试剂盒，直接在检测蛋白上标记检测用荧光素或微珠！
● 间接标记检测 HTRF技术或者Alpha技术提供Tool Box供科学家开发自己的蛋白互作模型，部分Alpha产品清单如下：
更多tool box、更大包装或者想开发HTRF检测模型或Alpha模型，可咨询优宁维电话：13262961889 3 Biacore SPR技术 Biacore拥有近30余年表面等离子共振（SPR）生物传感器的研发经验，是生物分子相互作用领域的技术引领者和标准制定者。Biacore利用SPR原理，常用于定性和定量检测蛋白与蛋白之间和蛋白与药物分子之间的相互作用，可提供的信息包括动力学，亲和力，特异性，热力学和浓度等等，检测范围大至细胞与病毒，小至化合物和化合物片段。Biacore技术被中国，美国和日本药典收录，广泛应用于基础研究，药物筛选和生物药物生产过程中的质量控制。
技术原理：BIACORE是基于表面等离子共振（surface Plasmon resonance, SPR）开发的新型生物分析传感技术。该技术的3个核心部分是传感器芯片，SPR光学检测系统和微射流卡盘。样品检测分为偶联，进样结合和再生3个步骤。实验时，先将一种生物分子固定在传感器的葡聚糖表面，再将与之相互作用的分子溶于溶液流过的芯片表面。SPR检测器能根据跟踪溶液中的分子与芯片表面的分子结合、解离整个过程的变化，记录成一张传感图，并提供动力学和亲和力数据。 技术特点：Biacore技术具有无需标记，高灵敏度，检测快速，非常广的应用范围以及可以对反应动态过程进行实时和连续的检测的特点，广泛应用于基础研究，药物筛选和生物药物生产过程中的质量控制。
|
|
|
