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胚胎干细胞 极早期胚胎中的原始干细胞（primitive stem cells）天生几乎能分化成任何细胞。这种能力可能让人类器官移植像给汽车换零件那样简单，很难不引起了生物科学家们的无限遐想。因此，体外维持干细胞的原始态多能性的研究越来越多。然而，根据《Nature》杂志报道的几项研究，体外维持细胞的多能性状态需要干细胞本身付出代价。 对于人类、小鼠这样的哺乳动物来说，他们在出生成为一个个体之前主要经历了受精卵、胚胎、胎儿这三个重要时期。怀胎十月，大概有40周，其中胚胎时期只有8周，受精卵的时间更短，大部分时间都是胎儿成形后的继续快速发育的过程。在胚胎发育时期，最终能形成胎儿的那些细胞依靠糖蛋白E-cadherin ，即钙离子依赖的细胞粘附素家族(Ca2+dependent cell adhesion molecule family)，紧紧地靠在一起，由它们所组成的结构被称为内细胞团（inner cell mas,ICM），而这些细胞则被称作多能干细胞（pluripotent stem cells，PSCs）。 天然多能性阶段（pluripotent state）持续时间很短，在小鼠体内仅持续几个小时。而在体外，由于没有了原有的促进分化因素的刺激，而且多能干细胞也需要对环境的改变做出一些预定程序之外的改变来适应环境，因此，多能干细胞的这种状态却能维持几周甚至几个月。
原始态多能干细胞的相对时间段 原始态多能性（naive pluripotency）是最原始的多潜能状态，通过使用一些激酶抑制剂使多能干细胞免受体内一些促进分化的激酶的刺激就可以让多能干细胞维持在这种状态下。为了探索PSCs的内部运作分子机制，以指导创造大量安全有效的能取代衰老病变细胞的健康细胞，相关的研究很早就开展了，科学家们让多能干细胞稳定在原始多能性阶段的实验条件已使用多年，其中就包括2008年Ying, Q. L. et al.开发出来的2i系统（二抑制法）。2i系统(细胞的培养基）采用两种小分子激酶抑制剂处理PCSs，一种叫PD，用来抑制MEK1和MEK2激酶，另一种叫做CHIR，用来抑制GSK3激酶。
PCSs自我更新和分化信号通路 6500万年前，一颗宽度约16公里的大型陨石撞击到了今天墨西哥的尤卡坦半岛上时，哺乳动物已经产生了。而地质学研究表明地球大约是在46亿年前形成的，然后便开始酝酿生命生存的条件。如此漫长的进化历程，经历过自然选择的自然有其存在的意义，特别是在细胞的重要生命活动中扮演重要角色的基因或蛋白对细胞肯定很重要；宏观来看，哺乳动物保留下来的自然发育分化进程肯定不能轻易修改。强行地用抑制剂来干预理应会产生不良的后果。
生命起源示意图(米勒实验） 人工干预多能干细胞自然发育进程来维持其原始态多能性阶段的效果如何呢？多能干细胞本身会发生什么消极的变化呢？根据《Nature》2017年报道的两篇文章，某些体外条件（例如2i培养基这样的生存环境）可引起小鼠PSCs发生深层次变化！ Choi和Yagi等人发现，体外培养维持原始态多能性，哪怕仅培养几个星期，都会影响其基因表达。阻止原始态多能干细胞自然进程就意味着停止其原来的基因表达模式，取而代之的肯定是另外一种表达模式。正常情况下，会通过去甲基化激活某些具有特定功能的基因，比如多能性维持基因。同时，其他基因，比如分化相关的基因的DNA保持较高水平的甲基化使它们转录沉默。换句话说，多能干细胞基因组的整体甲基化模式可以表征其所处的发育时期。
长期维持多能性导致基因组甲基化缺失 不同细胞类型，乃至幼稚细胞的DNA甲基化模式一般可以预见。以原始生殖细胞为例，精子和卵子在完成受精作用过后就开始主动降低自身基因组的甲基化水平，从趋势上来看，精子的甲基化水平比卵子高一点，也会率先发生去甲基化，而卵子基因组的去甲基化似乎是一个紧随的、被动的过程。这个过程将持续到囊胚阶段，此时受精卵中分别来自精子和卵子的的基因组的甲基化水平就相差无几了。在E7.5之前甲基化又逐渐上升，之后又快速去甲基化，到E13.5时就完全去甲基化。E13.5之后甲基化水平就有增无减了。
生殖细胞的甲基化水平变化 然而，2i培养基培养过的细胞的一些遗传特征甲基化模式出现缺损，其中包括基因组重复序列或某些基因的甲基化。DNA甲基化是CpG二核苷酸中的胞嘧啶C在甲基供体SAM和甲基转移酶DNMT的作用下在自身第五位碳原子加上一个甲基基团，可以通过调节DNA的构象、DNA与蛋白质的相互作用、染色质的结构以及基因组稳定性来调节基因表达。甲基化，特别是基因启动子区域的甲基化，可以使DNA大沟加深，降低与转录激活因子的亲和力等方式来沉默基因的表达。因此，甲基化信息的缺损直接将会导致某些本应该表达沉默的基因的异常表达。 很多发育障碍都与基因错误表达有关。Choi等人发现，2i处理甚至导致一些细胞获得或丢失了整条染色体。 为了观察这些体外基因组表观修饰的异常是否影响体内器官发育，两个研究团队都把体外培养的幼稚PSCs重新注回小鼠胚胎。结果显示，健康PSCs细胞很容易与原始胚胎细胞融合，甚至可在特定条件下被诱导形成完整胚胎。相比之下，经2i系统处理的细胞随体外培养时间的延长逐渐失去了这种能力，注射了这种细胞的胚胎显示发育异常，例如小鼠胎儿过度生长。 2i处理导致的甲基化缺失类似于早期胚胎除印迹区域之外的DNA 序列中自然发生的去甲基化。用体细胞核移植方法将2i处理细胞核转移到健康去核卵细胞内，原则上所有甲基化模式都将重启。Yagi等人发现，这并不能阻止“人工诱导印迹”导致的相关生长缺陷。 Choi和同事证明，2i培养所引起的所有不良反应主要来自MEK抑制剂，与GSK3抑制剂无关。因此，他们建议利用原始态多能干细胞进行疾病模型创建和治疗相关疾病的科研工作者们应谨慎使用MEK抑制剂。
体细胞核移植 两篇文章都试图用其他激酶阻断剂取代MEK抑制剂，但效果非常有限。这引发了一系列耐人深思的问题：MEK通路在早期胚胎发育中起什么作用？MEK通路的终点指向何方？如何保护原始态多能干细胞的MEK通路？ 这些问题的答案不仅帮助理解多能性，而且还能解释为什么MEK通路是最常见的癌症突变信号通路。2i处理造成的甲基化损失与体内早期胚胎“印迹区”以外的所有DNA序列自然发生的去甲基化过程类似。这又引申出另一问题——为什么早期胚胎基因组首先要去甲基化呢？重复元件（如转座子）被高度甲基化，也许是它们在早期发育阶段需要被瞬时激活。如果如此，则意味着我们的基因组本身与基因组里某些外来元素之间有着很深的共生关系。 DNA甲基化是一种非常重要的表观遗传调控方式,在基因印迹、X染色体失活、转座子与外源DNA的沉默及组织特异性基因的中发挥着重要的作用。在哺乳动物的配子发生过程及从受精到着床的早期胚胎发育阶段,基因组DNA发生大规模的主动去甲基化。但去甲基化的分子机制一直是表观遗传领域的谜题。2009年,Anjana Rao及其同事发现一种DNA双氧化酶TET蛋白能够将5-甲基胞嘧啶氧化成5-羟甲基胞嘧啶,这为DNA去甲基化的机制研究开拓了新的思路。在此基础上,徐国良实验室展开了深入研究,发现TET蛋白能够进一步将5-羟甲基胞嘧啶氧化成5-羧基胞嘧啶,并发现糖苷酶TDG能够特异性地识别并切除DNA中的5-羧基胞嘧啶,进而启动碱基切除修复途径完成DNA去甲基化,从而提出了氧化作用与碱基切除修复途径协同介导的DNA主动去甲基化机制。 参考文献： 1.Choi, J. et al. Nature Prolonged Mek1/2 suppression impairs the developmental potential of embryonic stem cells (2017). 2.Yagi, M. et al. Nature Derivation of ground-state female ES cells maintaining gamete-derived DNA methylation (2017). 3.Dejosez, M. & Zwaka, T. P. Annu. Rev. Biochem Pluripotency and nuclear reprogramming (2012). 4.Ying, Q. L. et al. Nature The ground state of embryonic stem cell self-ren (2008). ------------------------------------------------------------------------ 嫌太长不爱看的看这： MEK抑制剂PD维持的原始态多能干细胞基因组甲基化水平下调，基因组稳定性变差，使其不能正常发育。 |
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