Injectable hybrid inorganic nanoscaffold as rapid stemcell assembly template for cartilage repair
作者：Shenqiang Wang, Letao Yang, Bolei Cai, Fuwei Liu, Yannan Hou, Hua Zheng, Fang Cheng, Hepeng Zhang, Le Wang, Xiaoyi Wang, QianxinLv, Liang Kong, Ki-Bum Lee, Qiuyu Zhang（Key Laboratory of Special Functional and Smart Polymer Materials of Ministry of Industry and Information Technology, School of Chemistry and Chemical Engineering, Northwestern Polytechnical University, Xi'an 710129, China.）
发表期刊：Natl Sci Rev. 2022 Feb 28;9(4):nwac037.
doi: 10.1093/nsr/nwac037. eCollection 2022 Apr.
软骨组织内在的再生能力低，大多数软骨损伤没有治愈的可能。三维干细胞培养系统的兴起显示出了巨大的治疗潜力。然而，在实现干细胞疗法的治疗之前，还有一些关键障碍需要克服。干细胞在体内向软骨方向的分化难以精确控制，往往导致再生结果受到影响。此外，由于损伤部位的微环境中普遍存在氧化应激和炎症，干细胞在注射后经常发生凋亡。
研究人员展示了一种用于三维干细胞培养和植入的三维IHI纳米支架诱导的干细胞组装系统。三维IHI纳米支架通过定制的3D细胞基质相互作用，迅速将干细胞组装成可注射的组织结构，在组装的3D培养系统中均匀地输送软骨蛋白，并通过纳米地形效应可控地诱导软骨生成。
软骨损伤通常是毁灭性的，由于软骨组织固有的再生能力低，大多数软骨损伤无法治愈。尽管干细胞治疗显示出巨大的软骨修复潜力，但体内存活率低和软骨细胞分化能力差限制了其治疗效果。在这里，我们报道了一种可注射的无机混合（IHI）纳米复合物，它可以促进干细胞的快速组装，提高存活率并调节干细胞向软骨分化。与细胞外基质（ECM）蛋白强结合的IHI纳米复合物通过协同3D细胞-细胞和细胞-基质相互作用来组装干细胞，为干细胞在体外和体内的存活和分化创造有利的物理微环境。此外，软骨生成因子可以高容量的装载到纳米支架中，这使得药物能够深入、均匀地输送到组装的3D干细胞衍生组织中，通过可溶性微环境高效地控制干细胞的生长分化。已开发的与干细胞组装的IHI纳米复合物是可注射的。它们还能清除活性氧，并及时进行生物降解，便于正确整合到受损的软骨组织中。将干细胞组装的IHI纳米复合物植入受损软骨可加速组织再生和功能恢复。通过IHI纳米折叠模板三维干细胞组装方法的建立，我们提供了一种有效方法来改善与软骨损伤相关的抑制性微环境，并推进当前基于干细胞的组织工程疗法的应用。
Cartilage injuries are often devastating and most cannot be cured because of the intrinsically low regenerative capacity of cartilage tissues. Although stem-cell therapy has shown enormous potential for cartilage repair, the therapeutic outcome has been restricted by low survival rates and poor chondrocyte differentiation in vivo. Here, we report an injectable hybrid inorganic (IHI) nanoscaffold that facilitates fastassembly, enhances survival and regulates chondrogenic differentiation of stem cells. IHI nanoscaffolds that strongly bind to extracellular matrix (ECM) proteins assemble stem cells through synergistic 3D cell–celland cell–matrix interactions, creating a favorable physical microenvironment for stem-cell survival and differentiation in vitro and in vivo. Additionally, chondrogenic factors can be loaded into nanoscaffolds with a high capacity, which allows deep, homogenous drug delivery into assembled 3D stem-cell-derived tissues for effective control over the soluble microenvironment of stem cells. The developed IHI nanoscaffolds that assemble with stem cells are injectable. They also scavenge reactive oxygen species and timely biodegradefor proper integration into injured cartilage tissues. Implantation of stem-cell-assembled IHI nanoscaffoldsinto injured cartilage results in accelerated tissue regeneration and functional recovery. By establishing our IHI nanoscaffold-templated 3D stem-cell assembly method, we provide a promising approach to better overcoming the inhibitory microenvironment associated with cartilage injuries and to advance currentstem-cell-based tissue engineering.
图1：可注射的混合无机（IHI）纳米支架-干细胞组件增强软骨损伤的治疗效果。
(a1) 3D TGFβ–BMSC–IHI组合物示意图。
(a2) 3D-IHI纳米支架既能实现细胞间的相互作用，又能促进细胞-基质的相互作用，有利于BMSC向软骨细胞分化。
(a3) MnO2NTs的中空结构有利于加载促软骨生成药物或生长因子。
(b) 明胶涂层和TGF-β3负载MnO2 NTs的示意图。
(c) FESEM图像显示，大多数骨髓间充质干细胞与其他细胞形成接触，纤维样的结构类似于自然组织的结构。BMSC的软骨生成效果增强通过软骨生成蛋白（Aggrecan）的免疫染色证实。
(d) 通过重塑氧化微环境，增强移植细胞的细胞活力和软骨生成，最终可实现软骨再生。
图2：使用可生物降解的纳米材料合成3D-IHI纳米支架。
(a) 示意图显示3D-IHI纳米复合物可通过N-钙粘蛋白和FAK介导的协同作用增强BMSC向软骨方向分化。
(b) SEM图像显示, MnO2-NTs与ECM蛋白中常见官能团的强相互作用，可有效支持细胞附着。
(c) 二辛可宁酸含量测定分析表明，与对照组相比，MnO2 NT对明胶的吸收增强。(d) FAK基因表达上调证明了MnO2NT模板组装方法显著增强了细胞与基质的相互作用。
(e) 具有代表性的免疫染色图像显示了BMSC–IHI纳米支架组中的BMSC与对照组相比软骨形成能力增强。
(f)- (h) qRT-PCR检测软骨相关基因SOX9、聚集蛋白聚糖和Col II的表达。
图3：深层输送可溶性因子，促进干细胞软骨分化。
(a)在TGFβ–BMSC–IHI纳米支架中监测药物释放示意图。
(b) TGF-β3的有效均匀输送进一步促进BMSC通过Smad通路向软骨细胞分化。
(c) 荧光显微图像显示模型生物大分子药物（Dex–RhB）在MnO2-NT-Dex–RhB IHI纳米支架中的深度均匀输送情况，对照组是用游离Dex–RhB孵育的BMSC球体。
(d) 免疫荧光检测软骨生成标记物。结果显示与BMSC-IHI相比，TGFβ–BMSC-IHI纳米复合物对BMSC软骨方向分化有促进作用。
(e) 细胞培养过程中MnO2 NTs的生物降解表现出时间依赖性，无需添加任何外部触发器。碳纳米管（CNT）用作阴性对照，未观察到明显的降解。
图4：使用3D-IHI纳米复合支架在软骨损伤部位表现出更完善的干细胞移植块。
(a) 示意图说明软骨修复的手术过程和时间表。软骨损伤部位分别被TGFβ-BMSC–IHI 纳米支架和对照品充填。通过核磁共振成像观察MNO2 NTs的降解和再生过程。
(b) 为了鉴定我们移植的细胞，骨髓间充质干细胞被绿色荧光蛋白（GFP）基因标记。
(c) ROS探针的红色荧光信号显著减少，表明IHI纳米碳纤维中的MnO2 NTs能有效清除缺损区的活性氧，同时细胞增殖标记物Ki67高表达。
(d) 通过计数剩余的GFP+细胞数，与其他细胞移植组相比，TGFβ–BMSC–IHI纳米复合物可显著保留移植后的细胞。
(e) ROS探针荧光强度直方图显示了MnO2-NTs组可有效清除ROS。
(f) 缺陷区域中Ki67+细胞的量化。
图5：使用3D-IHI纳米复合物可促进BMSCs的体内软骨生成。
(a) 移植后短期的软骨分化示意图。
(b) HE染色，番红O染色，Col II免疫化学染色检测体内软骨细胞分化。
(c) 细胞成分定量和ECM成分定量结果共同表明，通过MnO2-NT模板支架细胞组装和TGF-β3的均匀传递可以改善软骨细胞分化。
图6：3D-IHI纳米支架复合物移植加速体内软骨修复。
(a) 移植后长期(3个月)的软骨生成示意图。
(b) HE染色，番红O染色，Col II免疫化学染色表征体内软骨形成情况。
(c)- (h) 通过一系列量化：软骨厚度定量（通过HE染色）(c)，细胞成分（通过番红O染色）(d)和ECM成分（通过Col II免疫组化染色）(e), ICRS观结果(f)组织学评分(g)表明TGFβ–BMSC–IHI纳米支架组的软骨缺损修复质量显著改善。OARSI评分降低表明TGFβ–BMSC–IHI纳米复合物可以防止骨关节炎（h）恶化。这些结果共同表明，通过MnO2-NT模板细胞组装和TGF-β3的均匀输送可以改善软骨再生。
该研究制备的干细胞组装体中包含：骨髓来源间充质干细胞（BMSC）、一维MnO2纳米管（形成组装体结构），细胞外基质（ECM）蛋白（修饰纳米管与BMSC组装，促进细胞间和细胞与ECM间相互作用）和TGF-β3蛋白（负载于纳米管上，深入均匀释放进一步促进干细胞分化）。在被注射到软骨损伤部位后，这些成分可相互配合，从几方面促进干细胞向软骨分化，并提高细胞成活率，促进修复。鉴于基于三维IHI纳米支架的软骨再生具有良好的通用性和治疗效果，它可能帮助推进各种组织工程应用。
