Nature：突破！清华大学团队首次发现化学诱导全能干细胞的方法

从克隆技术到再生医学，如何找到除自然胚胎孕育之外的其他途径来创造或复原生命，一直是生命科学领域追求的一个目标。如何使已分化的体细胞重新获得分化能力，甚至在体外建立代表生命起点的全能干细胞，吸引着许多科学家投入其中。

2006年日本京都大学Shinya Yamanaka在Cell上率先报道了诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell, iPSC）的研究。Shinya Yamanaka等人把Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4四种转录因子基因引入小鼠成纤维细胞，发现可诱导其发生转化，产生的细胞在形态、基因和蛋白表达、表观遗传修饰状态、分化能力等方面都与胚胎干细胞高度相似。2012年10月8日，John B. Gurdon 与 Shinya Yamanaka 因iPSC技术获得诺贝尔生理学和医学奖。

然而，能够独立形成生命、发育成完整个体的细胞只有全能干细胞一种，如何让多能干细胞再升级，是生命科学领域待突破的新问题。

长期以来，通过非生殖细胞体外诱导、捕获和长期维持TotiSCs（全能干细胞）状态是一个悬而未决的问题。2022年6月21日，清华大学药学院院长丁胜教授团队在Nature上发表题名为Induction of mouse totipotent stem cells by a defined chemical cocktail文章，该研究确定了一种3个小分子组成的的药物组合，能将小鼠多能干细胞（mPSCs）诱导成TotiSCs并保持稳定。诱导成的TotiSCs在转录组、表观基因组、代谢组和胚胎和胚胎外谱系的发育潜能方面与小鼠全能2细胞阶段胚胎高度相似，意味着诱导的细胞具有全能性。该工作首次实现了从非生殖细胞体外诱导和维持真正的全能干细胞，代表了创造和理解生命的关键，具有从“0”到“1”的突破性意义。

化学筛选：寻找全能性细胞的诱导剂

MERVL-tdTomato报告基因是2细胞阶段胚胎的特异性分子标记。研究者首先从3000多种化合物鉴定出23种化合物，这23种化合物可以使mESCs 中MERVL-tdTomato阳性表达的细胞数量比对照组增加3倍。在此基础上，研究者又进行了药物组合设计和两轮化学筛选，发现有11个组合能够在体外诱导和长期维持MERVL-tdTomato阳性细胞。转录组测序和差异表达基因分析显示，在这11个组合中，TTNPB、1-Azakenpaullone和WS6（简称TAW）组合的诱导的细胞最接近小鼠2细胞阶段胚胎的细胞。该研究团队称这种药物组合为TAW鸡尾酒药物组合。

为了确认TAW诱导的细胞是否真正具有全能性， 研究团队运用流式细胞术、免疫荧光染色对多能性基因OCT4和NANOG表达进行分析，结果均证实大多数细胞发生了从多能性向全能性的重新编程。同时，RNA测序分析表明诱导后的mESCs中经典的全能性特异性基因几乎都高表达，而大多数多能性特异性基因则被沉默。GSEA分析发现TAW诱导后的细胞与受精卵和2细胞阶段细胞表达谱显著富集。这些结果均说明，TAW组合能够诱导mESCs转变为全能干细胞，并能够在多代体外维持正常二倍体核型。

诱导和维持小鼠多能干细胞的化合物组合筛选列表

分子特征比较分析：确认全能性

为了确证这一结果，作者拟将TAW诱导的TotiSCs（简称ciTotiSCs）与小鼠全能2细胞阶段胚胎在转录组、表观基因组和代谢组水平上作比较。转录组和单细胞转录组的主成分分析显示ciTotiSCs表现出从mESCs到2细胞阶段胚胎状态的完全转录谱转变。染色质转座酶可及性测分析表明，ciTotiSCs具有全基因组全能性特异染色质可及性，全基因组甲基化分析也揭示了ciTotiSCs与2细胞阶段胚胎的相似性。

除了对转录组和表观基因组的分析外，丁胜团队还对ciTotiSCs的代谢组进行了分析，发现ciTotiSCs和mESCs之间的代谢产物与全能性2细胞阶段胚胎和囊胚之间的代谢产物非常相似。深入分析表明，全能性的ciTotiSCs和2细胞阶段胚胎更倾向于单碳代谢和与还原状态相关的代谢途径，而多能的mESCs和囊胚具有更高水平的嘌呤代谢和线粒体三羧酸循环代谢产物，即更高的氧化状态。

ciTotiSCs在单细胞水平表现出的转录组特征接近全能性2细胞阶段胚胎

体内分化潜能验证：获得全能细胞表型

最后，为了再次证明诱导产生的细胞具有真正的全能性状态，研究小组在体外测试了它们的分化潜能，并将它们注射到小鼠早期胚胎中，以观察ciTotiSCs在体内的分化潜能。

他们发现，这些细胞不仅在培养皿中表现得像真正的全能细胞，而且在体内也能分化成胚胎和胚胎外谱系。全能性细胞具有发育成胎儿及其周围的卵黄囊和胎盘的潜能，而多能性细胞只能发育成胎儿，这正是全能性细胞的典型特征。这些数据表明ciTotiSCs能够高效地在生物体的胚胎和胚外组织中产生所有的分化细胞类型，在功能上类似于全能的卵裂球。

ciTotiSCs具有发育成胎儿及其周围的卵黄囊和胎盘的潜能

综上所述，这项研究证明了从非生殖细胞体外产生小鼠全能干细胞的可行性，并提供了一个确切的细胞诱导体系。据此，研究者将能更好地操纵和理解哺乳动物发育中的初始细胞命运决定机制，并探索有关生命起源的基本问题。从这个意义上来说，这篇论文迈出了探索生命起源的重要一步，为后续研究开辟了巨大的机遇。

参考资料：

Hu Y, Yang Y, Tan P, et al. Induction of mouse totipotent stem cells by a defined chemical cocktail [published online ahead of print, 2022 Jun 21]. Nature. 2022;10.1038/s41586-022-04967-9. doi:10.1038/s41586-022-04967-9.