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病菌对血红素解毒后在血液中增殖-分析膜蛋白对败血症和脑膜炎药物开发的贡献- 理化学研究所(理研)生命功能科学研究中心蛋白质功能结构研究小组的中村宽夫特别委托研究员、久野玉雄专职研究员、白水美香子小组组长、兵库县立大学研究生院理学研究科的城宜嗣特命教授、马哈茂德·拉曼研究生等的共同研究小组解开了排出来自宿主的血红素[2]的膜蛋白“ABC转运体[3]”的结构，血红素对病原菌(革兰氏阳性细菌[1] )来说是有毒的。本研究成果可以实现基于蛋白质立体结构和酶活性控制血红素排出能力的低分子化合物的设计和筛选，有望为开发阻碍人血中革兰氏阳性细菌增殖的药剂做出贡献。 败血症和脑膜炎是由细菌和病毒等微生物感染引起的。 在这些成为感染源的细菌中，金黄色葡萄球菌和链球菌属于没有外膜的革兰氏阳性细菌，为了使细胞膜暴露在宿主血中增殖时产生的“游离血红素[2]”中，可以认为具有将过剩的血红素排出细胞外进行解毒的功能。 虽然发现了负责该功能的候选ABC转运体的基因，但蛋白质水平的血红素排出机制尚不清楚。 此次，联合研究小组对作为膜蛋白的ABC转运体进行了生物化学分析，并使用大型辐射光设施“SPring-8[4]”进行了详细的x射线晶体结构分析[4]。 结果表明，该ABC转运体是捕捉侵入病原菌细胞膜的游离血红素，通过接下来发生的ATP结合引起的结构变化，将血红素挤出的汲水泵。 本研究将于近期刊登在科学杂志《proceedings of the national academy of sciences of the United States of America ( PNAS )》在线版上。
捕获侵入病原菌细胞膜的血红素并排出的ABC转运体HrtBA蛋白的结构 背景
铁对大多数生物来说是必须的元素。 生物体内的铁大多以铁离子被环状有机分子(卟啉)覆盖的血红素(铁原卟啉IX )的形式存在。 除了在自己细胞内合成的血红素外，我们还将消化吸收了食物中含有的来自其他生物的血红素的物质用作铁源和血红素源。 这些血红素与各种各样的蛋白质结合，承担着氧化还原反应和氧运输等生命活动所必须的大部分生化反应。 其代表例就是血红素与血红蛋白蛋白质结合后的血红蛋白。 另一方面，不与蛋白质结合的游离血红素产生活性氧，因此也已知具有细胞毒性。
入侵人体的病菌会从血红蛋白中夺取含铁的血红素，在血液中繁殖，但分解血红蛋白时会暴露在高浓度的游离血红素中。 有些细菌(革兰氏阴性细菌[1] )在细胞膜的外侧有屏障(外膜)，避免吸入过多的有毒游离血红素。 另一方面，不具有外膜的细菌(革兰氏阳性细菌)被认为进化了从细胞内排出血红素的机制。
金黄色葡萄球菌携带的一种革兰氏阳性细菌hrtBA基因[5]，作为血红素诱导表达的基因于2006年被发现，其基因产物称为“ATP-binding cassette(ABC )转运蛋白” 我们还发现HrtBA蛋白是革兰氏阳性细菌固有的蛋白质。 ABC转运蛋白是所有生物都有的膜蛋白，负责利用ATP[6]将物质转运到细胞内外。 缺失了hrtBA基因的细菌，对人血中存在的游离血红素浓度也很敏感，因此推测hrtBA蛋白质是侵入革兰氏阳性细菌细胞的排出过剩血红素的泵。 但是，到目前为止，HrtBA蛋白还没有在蛋白质水平上进行研究，使用ATP进行血红素排出的机制还不清楚(图1 )。 图1革兰阳性细菌血红素利用与解毒模型 吸收血红素的血红素导入物、将血红素分解并用作非血红素铁的血红素氧合酶的功能结构已经明确(左侧，功能区模型中显示的蛋白质分子)，但被推定为血红素排出泵的HrtBA蛋白质(右侧，灰色蛋白质)的结构仍未解决。 研究方法和成果 首先，联合研究小组验证了HrtBA蛋白质是否具有血红素的解毒能力。 分子生物学研究中常用的大肠杆菌实验室株K12被不通过血红素的外膜包裹，因此对血红素具有抗药性(图2A上段)。 利用重组DNA技术[7]使外源血红素进入该大肠杆菌细胞内时，增殖速度下降，由此可以确认血红素对该重组大肠杆菌有毒(图2A中段)。 在该血红素敏感性重组大肠菌株中进一步表达来自白喉杆菌的hrtBA基因后，增殖速度恢复了。 此结果表明，HrtBA蛋白确实能解毒血红素(图2A下段)。 接下来，为了研究HrtBA蛋白作为膜蛋白的性质，在表面活性剂存在下，从该重组大肠杆菌细胞膜中增溶纯化HrtBA蛋白，然后回填到脂质纳米盘[8]中，制成只有HrtBA蛋白嵌入的模拟细胞膜。 这样，确认了向纳米盘中重构的HrtBA蛋白质添加血红素时，会促进HrtBA蛋白质的ATP水解活性[6] (图2B )。 另外，还发现在使血红素与HrtBA蛋白质结合的情况下添加ATP时，血红素会从HrtBA蛋白质中游离出来(图2C、d )。
图2 HrtBA蛋白的功能分析 ( a )培养基中游离血红素浓度与大肠杆菌增殖能力的关系。 白浊的试管显示大肠杆菌在高密度地增殖。 原大肠杆菌实验室株K12对血红素不敏感，在游离血红素浓度高的培养液中也能增殖(上段)。 血红素敏感性重组体在浓度为1和10微摩尔( μM，1μM为百万分之一摩尔)的血红素中会发生生长抑制(中段)，如果在此基础上进一步表达HrtBA蛋白，就可以生长了(下段)。 ( b )重组为纳米盘的HrtBA蛋白的ATP水解活性由血红素促进。 纵轴表示ATP水解活性，横轴表示游离血红素浓度。 ( c )分析与HrtBA蛋白质结合的血红素解离的实验系统的示意图。 使血红素、HrtBA蛋白质、以及血红素结合蛋白质HasA同时反应后提取蛋白质，在不存在ATP或存在的情况下调查血红素与HrtBA蛋白质还是HasA蛋白质结合得多，并分析其比例。 MSP是用于纳米盘制作的膜圆盘形成蛋白质。 ( d )对实验体系中的总蛋白质(黑线柱状图)中，血红素与HrtBA蛋白质还是HasA蛋白质结合(红柱状图)进行分析的结果。 在不存在ATP的情况下，几乎所有的血红素都与HrtBA蛋白结合，但添加ATP后，会与HasA蛋白结合。 这表明，通过ATP结合，HrtBA蛋白的血红素结合亲和力降低，血红素解离，结果血红素转移到了HasA蛋白上。 以上结果提示，HrtBA蛋白依赖ATP改变与血红素的结合状态。 因此，我们决定通过分析HrtBA蛋白的立体结构来详细调查这一变化。 具体而言，制备了血红素结合型、结构与ATP类似的ATP模拟[6](AMP-PNP )结合型、无任何结合的自由型HrtBA蛋白质的结晶，并通过大型辐射光设施“SPring-8”进行了x射线结构分析。 这些立体结构分析揭示了HrtBA蛋白跨膜结构域[9]的血红素结合位点，同时可视化了跨膜结构域从自由型向血红素结合型的结构转换，以及ATP与ATP水解酶( ATPase )结构域的ATP结合导致的结构域结构转换 血红素结合部位位于细胞膜磷脂双层膜的外叶表面附近(图3B上段)。 自由型中，血红素结合域的跨膜螺旋[9]横向偏移，位于细胞膜外侧表面的谷氨酸暴露在蛋白质表面(图3A中段)。 从自由型变成血红素结合型时，谷氨酸与铁原子配位，4条跨膜螺旋夹住血红素进行了再定位(图3B中段)。 另一方面，ATP结合型通过在两个ATPase催化剂部位分别结合ATP (在本实验中为AMP-PNP )，成为催化剂亚基彼此接触的二聚体结构(图3C下段)。 随之，跨膜结构域的4个跨膜螺旋被捆绑在一起，血红素结合空间消失(图4 )。
图3 HrtBA的晶体结构 HrtBA蛋白的结构是，hrtB基因编码的hrtB亚基与hrtA基因编码的hrtA亚基配对，这一对hrtB亚基由两个hrtB亚基缔合。 成为缔合对象配对的亚基用“'”表示。 关于“SPring-8”得到的HrtBA蛋白质的立体结构，分别显示了( a )自由型、( b )血红素结合型、( c ) ATP模拟结合型。 上段是相对于膜从水平面观察的图，中段是从上方观察HrtB亚基的图，下段是从上方观察HrtA亚基的图。 TM是膜横断螺旋。 血红素结合部位如←所示(上段b )。
图4与ATP结合结构域的ATP结合引起的跨膜结构域结构变化 图2是放大了HrtB膜横断域血红素结合部位的图。 丝带模型表示蛋白质的螺旋结构，从丝带突出的棒模型表示氨基酸的侧链，中央的棒模型表示血红素，血红素中央的红圈表示铁。 蛋白质的结构变化通过颜色的不同表现出来，粉红色表示血红素结合态的结构，青色表示ATP结合态的结构。 由于亚基的ATP结合域与ATP结合，引起ATP结合域之间的缔合(图3C下段)，引起膜横断域螺旋的再配置。 在ATP模拟结合型中，血红素结合部位血红素结合空间消失。 E219表示血红素结合型中与铁原子配位的第219位谷氨酸的位置。
图5 HrtBA蛋白依赖ATP从细胞膜泵出血红素的模型 未结合ATP的HrtBA蛋白将从细胞外侧侵入的游离血红素从膜中抽出( State 1)，成为血红素结合型( State 2)。 此时，ATPase活性被激活，促进血红素解离，成为ATP结合型( State 3)。 通过ATP水解，血红素结合解离的反应会旋转。 今后的期待 革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌和链球菌在血液中的增殖，会引起败血症和脑膜炎等重病。 由于控制HrtBA蛋白质血红素排出能力的药剂有望抑制这些病原菌在血液中增殖，因此，以此次明确的结构信息为基础的药剂设计和基于功能分析的药剂筛选，有望为新药剂的开发做出贡献。 补充说明 1 .革兰阳性细菌，革兰阴性细菌 革兰氏阳性细菌是通过革兰氏染色将细胞外皮染成紫色的细菌群。 染成淡红色的革兰氏阴性细菌(大肠杆菌和铜绿假单胞菌等)具有细胞膜、肽聚糖层、外膜，而革兰氏阳性细菌具有细胞膜和肽聚糖层作为细胞外皮。 金黄色葡萄球菌、链球菌、炭疽菌、乳酸菌等所属。 另外，白喉菌和分枝杆菌虽然是革兰氏阳性细菌，但已知具有特异的外膜，但与革兰氏阴性细菌的外膜不同，对血红素具有通透性。 因此，这些细菌的细胞膜也暴露于外源血红素，因此被认为具有HrtBA蛋白。 2 .血红素，游离血红素 环状有机分子(卟啉)的一种原卟啉IX中央螯合铁的金属络合物，是与各种血红素结合蛋白(血红素蛋白)结合起作用的辅基分子族。 它与血红蛋白中的氧转运、细胞色素中的电子传递等许多生物重要的生物反应有关。 由于血红素难溶于水，在生物体内从血红素蛋白质中游离的血红素弱地与脂质和其他蛋白质结合。 在此，将不与血红素蛋白特异性结合的血红素称为“游离血红素”。 3.ABC转运蛋白 一个膜蛋白家族，将三磷酸腺苷( ATP )水解时获得的化学能转换为机械能，用来输送物质。 它以ATP-Binding Cassette (ABC )为共同的驱动源单元，广泛分布于从细菌到动物、植物的各种领域。 膜域各自分化多样，膜转运各种物质。 4.SPring-8，x射线晶体结构分析 “SPring-8”是理化学研究所在兵库县播磨地区运用的产生世界最高性能x射线的大型放射光设施。 被用于很多蛋白质结构分析。 x射线晶体结构分析是根据对结晶化的试样照射x射线时的衍射图案取得电子密度分布，从而分析分子立体结构的方法。 5.hrtBA基因 在金黄色葡萄球菌中发现的ABC转运体的基因。 制作由膜横断亚基的HrtB和具有ATP水解活性的亚基的HrtA构成的杂四聚体分子。 Hrt是Heme Regulated Transporter的缩写。 6.ATP、ATP水解活性、ATP模拟 ATP是生物普遍存在的磷酸化合物之一，由于三个磷酸与碱和糖结合的化合物(核苷)结合，故称为三磷酸腺苷。 如果一个磷酸通过水解解离，就会变成二磷酸腺苷( ADP )。 与ATP结合并催化水解的蛋白质的酶活性称为ATP水解活性，通过该反应获得的能量被用于各种蛋白质功能。 ATP类似物是指结构与ATP相似的化合物，本实验采用难水解的ATP类似物AMP-PNP进行了结合ATP状态下的蛋白质立体结构分析。 7 .重组DNA技术 取出特定的基因进行加工后，放回同种或异种生物细胞内改变这些生物性质的技术。 本研究将沙雷氏菌来源的外膜血红素通透蛋白基因chuA和白喉菌来源的血红素排出泵基因hrtBA克隆到质粒中，转入大肠杆菌K12株。 8 .纳米磁盘 使用膜圆盘形成蛋白质( Membrane Scaffold Protein )，将作为生物膜构成成分的磷脂双层膜层包围成直径10纳米( nm，1nm为10亿分之一米)左右的圆盘状的膜蛋白重构系统。 同时，可以将膜蛋白嵌入脂质膜中。 9 .领域，螺旋 蛋白质中，表现出统一结构功能的区域称为结构域。 螺旋是蛋白质的主要次级结构之一，是蛋白质的一部分呈螺旋结构。 膜蛋白中，多为多个螺旋束穿透膜。 10 .活性氧物种 氧虽然富有反应性，但在生物体内比较稳定，但如果从血红素等其他物质接收到对电子，反应性会一下子变高。 有过氧化物、羟自由基、一氧化氮等，称为自由基。 虽然不是自由基，但过氧化氢和臭氧也属于活性氧种。 活性氧种对生物体内重要的核酸、蛋白质、脂质产生氧化障碍，因此有毒。 |
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