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N - （6- 苯基硫烷基-1H-苯并咪唑-2-基）氨基甲酸甲酯对遍在蛋白 - 蛋白 酶体途径的损害导致肿瘤细胞中有效的细胞毒作用 一种具有潜在治疗意义的新型抗增殖剂 来自印度潘吉布大学国家人类基因组研究与研究中心，印度昌迪加尔160014 摘要近年来，人们对蛋白酶体抑制剂作为一类新型抗癌药物产生了很大的兴趣。我们报道，芬苯达 唑（FZ）（甲基N - （6-苯基硫烷基-1H-苯并咪唑-2-基）氨基甲酸酯）对癌细胞系显示出有效 的生长抑制活性，但不是正常细胞。我们在这里使用荧光底物显示，FZ处理导致细胞中蛋白酶 体活性的抑制。琥珀-LEU-LEU-VAL-酪氨酸- methylcoumarinamide（MCA），苄氧羰基亮氨酸-亮氨酸-谷氨酸-7-酰氨基-4- MCA和别用于评估胰凝乳蛋白酶样，谷氨吨- 丁氧基羰基-Gln-Ala-Arg-7-酰氨基-4-MCA荧光衍生物分 肽水解和胰蛋白酶样蛋白酶活性。用编码pd1EGFP的表酰基达质粒瞬时转染并用FZ处理的非小细胞肺癌细胞由于其半衰期的增加而在细胞中显示绿色荧光 蛋白的积累。发现通常由遍在蛋白 - 蛋白酶体途径如细胞周期蛋白，p53和IκBα降解的许多凋亡 调节蛋白在FZ处理的细胞中积累。此外，FZ诱导了不同的ER应激相关基因，如GRP78， GADD153，ATF3，IRE1α和NOXA在这些细胞中。因此，用苯达唑唑处理人NSCLC细胞诱导内 质网应激，产生活性氧物质，降低线粒体膜电位和细胞色素c释放，最终导致癌细胞死亡。这是 首次报道芬多唑对人肺癌细胞系中蛋白酶体功能的抑制和内质网应激/活性氧依赖性细胞凋亡的 抑制作用，这可能代表了一类新的抗癌药物，对癌细胞具有选择性毒性。 关键词：抗癌药物，细胞凋亡，细胞生长，ER应激，p53，蛋白酶体，活性氧（ROS） 介绍 蛋白酶体是主要的蛋白水解复合物，负责真核生物中许多细胞蛋白的降解。蛋白酶体在细胞质 和细胞核中都很丰富，它们催化短寿命调节蛋白的ATP依赖性蛋白水解以及错误折叠，受损和 异常蛋白质。癌细胞积累更多氧化或突变/受损的蛋白质，这些蛋白质被蛋白酶体有效地去除。 因此，它们很可能是更加依赖蛋白酶体的活性与正常细胞（比较1，2）。有了这个理由，蛋白 酶体已成为治疗人类癌症的目标。Bortezomib是美国食品和药物管理局批准用于治疗晚期恶性 血液病患者的第一种蛋白酶体抑制剂。不幸的是，治疗的功效仅限于狭窄的治疗窗口。硼替佐 米作为单一药剂在非小细胞肺癌的活性有限，并且在前面已经报道具有在H460异种移植物没有 抗肿瘤活性（3，4）。因此，寻找可以优先根除癌细胞的新型蛋白酶体抑制剂对于有效治疗疾 病具有高度优先性。 芬苯达唑（N-（6-苯基硫烷基-1H-苯并咪唑-2-基）氨基甲酸甲酯）是属于苯并咪唑类的驱虫 药，主要用于治疗动物的pin虫（图 1A）。临床上，两种苯并咪唑衍生物，甲苯咪唑（甲基5-苯甲酰基-2-苯并咪唑 - 氨基甲酸酯）和阿苯达唑（甲基（5-丙硫基）-1H-苯并咪唑-2-基氨基甲酸甲酯）已用于治疗人类肺泡包虫病，致死性肺蠕虫感染（5）。虽然虫病需要与甲苯咪唑长期高 剂量治疗，严重的副作用到主机的发生率是相当低的（6，7）。因此，苯并咪唑作为驱虫剂具 有良好的记录，并且在人类中具有广泛的安全性。这些药物对寄生虫的选择性是基于寄生虫摄 取葡萄糖的不可逆阻断来解释的，这导致生殖层中糖原储存的消耗和内质网的退化，导致细胞 死亡（8）。此外，还报道了这些药物对寄生虫的β-微管蛋白的优先亲和力与宿主相比（9）。 虽然FZ已知抑制聚合和改变寄生细胞微管功能，其对哺乳动物的微管蛋白的影响还没有被看着（10 - 12）。据报道，该类别的另一种化合物甲苯咪唑在人癌细胞中具有轻微的微管蛋白解聚 活性。这种优先结合寄生虫微管蛋白的结构解释是基于哺乳动物和寄生虫之间某些关键残基的 差异，导致苯并咪唑结合的疏水口袋的“封闭”，从而使其难以接近（13）。在过去，已经出现 了关于人类癌症（使用苯并咪唑驱虫药的几个报告14 - 18），但它们的抑制作用的分子机制仍 不清楚。
在本研究中，我们报道用芬苯达唑（FZ）3治疗人肺癌细胞系诱导凋亡细胞死亡，而培养中的 原代正常细胞仍然广泛不受影响。FZ可能通过干扰蛋白酶体功能和诱导未折叠蛋白反应发挥其 细胞毒性，最终通过细胞凋亡的内在途径导致癌细胞死亡。 实验步骤细胞培养和化学品 所有细胞系在Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）中培养，所述培养基补充有10％热灭活的胎牛血清（FBS）和1x青霉素/链霉素抗生素（100单位/ ml青霉素和100μg/ ml 链霉素）。根据各种实验的需要，用芬苯达唑，环己酰亚胺，MG132，NAC，TNFα，Z-VAD- FMK，Tiron或秋水仙碱处理细胞。 FZ; 3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化物（MTT）; 秋水仙碱; MG132; 放线菌酮; JC-1（5,5'，6,6'-四氯-1,1'，3,3'-四乙基 - 苯并咪唑羰基酞菁碘化物）; Hoechst 33342; 碘化丙锭;N-半胱氨酸; TNFα; Z-VAD-FMK; 蛋白酶体和半胱天冬酶底物; 钛铁试剂; 抗β肌动蛋白; 抗乙酰Kip1泛素; 抗GFP; anti-p27; 抗Bcl2; 抗小鼠IgG-荧光素异硫氰酸酯（FITC）; 辣根过氧化物酶（HRP） - 缀合的抗小鼠，抗兔和抗山羊IgG; 并且所有细胞培养试剂均购自Sigma。IKK抑制剂 wedelolactone从Calbiochem获得。抗p53（Bp53-12和DO1），抗p21，抗MDM-2，抗细胞周期蛋 白B1，抗Bax，抗细胞色素c抗-IκBα和抗磷酸-JNK购自Santa Cruz Biotechnology，Inc。（Santa Cruz，CA）。 细胞活力检测 将细胞（5×10 3细胞/孔）接种到96孔板中，接种后24小时，用不同剂量的芬苯达唑处理细胞。通过MTT测定法测量细胞活力。对于细胞计数测定，将细胞以1×10 4细胞/孔的密 度接种在24孔培养板中，然后用FZ处理。在指定的时间点收获细胞，并通过台盼蓝排除法计数 活细胞。所有实验一式三份进行。 Hoechst /（ 染色碘化丙啶 PI ） 在FZ处理后，将Hoechst 33342和PI以100ng / ml浓度添加到培养基中15分钟，然后用预热的PBS洗涤细胞，并在荧光显微镜下检查以检测凋亡细胞。 FACS分析 用FZ处理指定的时间间隔后，收获细胞，用PBS洗涤，并在4℃下在70％乙醇中固定过夜。第二天，将细胞以1000rpm离心5分钟，小心吸出上清液，将沉淀重悬于含有40μg/ ml PI 和100μg/ ml RNase A的PBS中（19）。在BD FACSArray系统上进行FACS分析，并使用FlowJo 软件分析数据。 TdT分析 将H460细胞以亚汇合密度接种在35-mm组织培养板中的盖玻片上。接种后24个小时，细胞不处理或暴露于1μ 米秋水仙碱FZ或130纳摩尔24小时。加尾反应物如由Gold所述进行（20）。简言之，在处理后，用PBS洗涤细胞并固定在1：3乙酸甲醇中。固定后，用PBS冲洗细胞，并在潮湿的室中于37℃孵育0.25单位/ mlλ外切核酸酶10分钟。再次用PBS洗涤细 胞，并在5μl50nmol生物素-dUTP存在下，在潮湿的室中与20单位/ ml TdT酶一起在37℃温育1小 时。然后通过在室温下在甲醇中的3％过氧化氢中温育15分钟来阻断内源过氧化物酶活性。最后 使用来自ABC试剂盒（Vector）和3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐底物（Sigma）的抗生物素蛋白 - 生物素复合物进行检测。 DNA片段化分析 如前所述进行DNA片段化测定（17）。用冷PBS洗涤对照和FZ处理的细胞。将细胞沉淀在裂解缓冲液（10m M Tris（pH 7.4），10m M EDTA（pH 8.0）和0.5％Triton X-100） 中裂解，并在4℃下孵育10分钟，然后与200μg一起孵育。 / ml RNase A在37°C下保持1小时。离 心后，将上清液与200μg/ ml蛋白酶K在50℃下孵育30分钟。接着，DNA片段用0.5沉淀米 NaCl 和50％的异丙醇，和将样品装入2％琼脂糖TBE凝胶，并用溴化乙锭染色。 免疫荧光 细胞在盖玻片上生长，并用1μ处理米 FZ或130纳摩尔秋水仙碱24小时的。处理后，用PBS洗涤细胞，并用4％多聚甲醛固定剂固定。再次用PBS洗涤细胞，并在4℃下与p53抗体一起 温育过夜。第二天，在用PBS洗涤数次后，将细胞在FITC-缀合的二抗中于37℃温育1小时。在 荧光显微镜下观察染色的细胞。 线粒体膜电位和细胞色素 释放的测量 c将A549细胞以亚汇合密度接种在35-mm组织培养板中的盖玻片上。24个小时后，将细胞暴露于指定剂量FZ的24个小时或10μ 米 12个小时MG132，它们被孵 育5μ以下米中的CO JC-1染料30分钟2培养箱中培养。在用预热的PBS洗涤数次后，使用568nm 滤光器在荧光显微镜下定性评价线粒体膜电位。 使用免疫荧光染色检查细胞色素c的定位。如前所述，用盖玻片或MG132处理在盖玻片上生长 的细胞。处理后，用PBS洗涤细胞两次，用PBS中的4％多聚甲醛固定20分钟，用PBS中的 0.05％Triton X-100透化5分钟，充分洗涤，然后用PBS中的山羊血清封闭30分钟。一抗（抗细胞 色素c）孵育在4℃下进行过夜。用PBS洗涤几次后，将细胞与FITC缀合的二抗在37℃温育2小 时，洗涤数次，并在荧光显微镜下观察。 蛋白酶体和样蛋Caspase-3 白酶活性的测定 过夜培养后，将细胞与不同剂量的FZ或10μ处理米为指定的时间周期MG132。然后分离细胞并加工蛋白酶体活性和半胱天冬酶-3样蛋白酶活性测定（21）。荧光底物琥珀酰-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA，Z-Leu-Leu-Glu-7-酰氨基-4-MCA，Boc-Gln- Ala-Arg-7-酰氨基-4-MCA和Ac- Asp-Glu-Val-Asp-MCA分别用于测定胰凝乳蛋白酶活性，肽基谷氨酰肽水解活性，胰蛋白酶样活性和半胱天冬酶-3样蛋白酶活性。对于测定法中，对照细胞提取物用各种剂量的FZ培养4个小时或与5μ 米如所示，FZ进行不同体外 并测定蛋白酶活时间，性。为了评估FZ对蛋白酶体蛋白酶活性的直接影响，在蛋白酶活性测定缓冲液中使用纯20S蛋 白酶体（100ng /反应）代替细胞上清液。在线性范围内的特定时间点（30分钟）的蛋白酶活性 用于计算数据。使用PerkinElmer Life Sciences Victor X3荧光板读数器在380nm激发和460nm发射下测量荧光强度。 RT-PCR和定量PCR 用FZ处理细胞，并使用硫氰酸胍法分离总RNA（22）。简而言之，处理后，将细胞用PBS洗涤并裂解，并在400微升溶液d（4收集米硫氰酸胍，0.75 米的柠檬酸钠，10％Ñ -laurylsarcosine，和0.1 米 β巯基乙醇）。这之后通过加入40μl的2 米乙酸钠（pH4.0），400μl水 饱和的苯酚和40μl49：1氯仿/异戊醇。然后将其混合并在冰上温育15分钟并在4℃下以9000rpm 离心10分钟。用等体积的异丙醇沉淀RNA，重悬于焦碳酸二乙酯处理的水中，并使用分光光度 计定量。最后，使用oligo（dT）18引物逆转录RNA ，并进行RT-PCR分析。对于定量PCR，使 用来自Eppendorf的RealMasterMix SYBR ROX试剂盒。根据Eppendorf Mastercycler Realplex实时 PCR仪中的制造商说明设置反应。 共免疫沉淀和免疫印迹实验 与pd1EGFP质粒转染后24个小时，将细胞用不同剂量的FZ或10μ处理米 8小时MG132。然后用冷PBS洗涤细胞，并用Nonidet P-40裂解缓冲液（50m M Tris，pH 8.0,150m M NaCl，1％Nonidet P-40，完全蛋白酶抑制剂混合物）在冰上裂解30分钟。将细胞裂 解物短暂涡旋并在4℃ 以15,000× g离心10分钟，并将上清液（总可溶性提取物）用于免疫沉 淀。使用牛血清白蛋白作为标准，根据Bradford的方法测量蛋白质浓度（23）。对于每个免疫 沉淀实验，将0.2μgNonidetP-40裂解缓冲液中的200μg蛋白质与5μl（2.5μg）GFP抗体一起温育。 在4℃下旋转过夜孵育后，加入20μl蛋白A / G-琼脂糖珠，并在4℃继续孵育5小时。用Nonidet P- 40裂解缓冲液洗涤珠子六次。用SDS（1×）样品缓冲液从珠子上洗脱结合的蛋白质，涡旋，煮 沸5分钟，并通过免疫印迹分析。通过10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离总细胞裂解物或免疫 沉淀的蛋白质，并转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（24）上。将膜依次在封闭缓冲液（TBST 中的5％脱脂乳（50m M Tris，pH 7.5,0.15）中孵育M NaCl，0.05％Tween-20））与一抗，然后与 二抗与辣根过氧化物酶缀合。用来自Millipore的增强化学发光试剂进行检测。所有一抗均以1：4000稀释度用于免疫印迹。 组蛋白H1激酶测定 市售纯化的组蛋白H1（Sigma公司）用CDK2从H460全细胞提取物相当于总蛋白的100微克在50μl激酶反应缓冲液中进行免疫沉淀（50米孵育米的Tris，pH 7.2的10米米的 MgCl 2，1米米 DTT，5μCi[γ- 32 P] ATP）在25℃下保持10分钟。通过SDS-PAGE分析样品，然 后进行放射自显影。 脉冲追踪实验分析蛋白质稳定性将细胞接种到35-mm组织培养板上，第二天，将它们保持未处理或用FZ处理，并在环己酰亚胺存在下追踪指定的时间。然后使用针对p53，细胞周期蛋白B1， IκBα或Bax的抗体处理在每个时间点收集的细胞用于免疫印迹。为了研究GFP稳定化，使用 Lipofectamine用pd1EGFP质粒转染H1299细胞。第二天，将细胞或向左未处理或用5μ处理米 FZ 和在放线菌酮的存在下，所指示的持续时间追。在指定的时间点后在荧光显微镜下观察它们， 或者如上所述使用抗GFP抗体进行免疫印迹处理。 电泳迁移率变动分析 EMSA用不同剂量的FZ处理H460细胞4小时，然后根据Schreiber制备核提取物（25）。简言之，用冷PBS洗涤2×10 6个细胞，并悬浮于0.4ml裂解缓冲液（10MHEPES，pH 7.9,10 m M KCl，0.1 m M EDTA，0.1 M EGTA，1 m M DTT，0.5）中。米米苯甲基 磺酰氟，2.0μg/ ml亮抑酶肽，2.0μg/ ml抑肽酶和0.5mg / ml苯甲脒）。使细胞在冰上溶胀15分 钟，然后加入12.5μl10％Nonidet P-40。然后将管在涡旋机上剧烈混合10秒，并将匀浆物离心30 秒。将核沉淀重悬于25μl冰冷的核提取缓冲液（20 m M HEPES，pH 7.9,0.4 M NaCl，1 m M EDTA，1 M EGTA，1 m M DTT，1 m M）中苯甲基磺酰氟，2.0μg/ ml亮抑酶肽，2.0μg/ ml抑肽 酶和0.5mg / ml苯甲脒），将管在冰上温育30分钟，间歇混合。然后将其在4℃下离心5分钟，立 即使用上清液（核提取物）或在-70℃下储存备用。通过Bradford（23）的方法测量蛋白质含 量。 通过将6μg核提取物与16fmol 32 P末端标记的45-mer双链NFκB寡核苷酸5'- TTGTTACAAGGGACTTTCCGCTGGGGACTTTCCAGGGAGGCGTGG-3'（26）在37℃ 温育30分钟来进行EMSA 。孵育混合物由2-3μg聚（dI-dC）的结合缓冲液（25m M HEPES，pH7.9,0.5m M EDTA，0.5m M DTT，1％Nonidet P-40,5％甘油和50 m M NaCl）。将形成的DNA-蛋 白质复合物与5％天然聚丙烯酰胺凝胶上的游离寡核苷酸分离，然后干燥凝胶。通过使用过量的 未标记的寡核苷酸进行竞争来确定结合的特异性。 ER应激的分泌碱性磷酸酶（SEAP ）测定 将293T细胞接种在96孔板中，第二天用pSEAP-con质粒（Clontech）转染，其组成型表达SEAP。转染后24小时，将细胞保持未暴露或在含有1％FBS的 新鲜培养基中暴露于不同浓度的指定药物。孵育24小时后，取出10μl条件培养基，并根据制造 商（Clontech，Palo Alto，CA）描述的方案使用4-MUP底物评估SEAP活性。简言之，将10μl培 养基与15微升5×SEAP测定缓冲液（0.5混合米为50微升，在96孔板中的总体积的Tris，pH值 9.0，和0.5％BSA）并在65℃温育30分钟灭活内源性SEAP活性。将板在冰上冷却2分钟。然后25μl的1 m M向各孔中加入4-甲基伞形酮磷酸酯底物，并在37℃下孵育2小时。使用96孔荧光板 读数器（PerkinElmer Multilabel reader Victor X3）测定SEAP的活性，激发设定为355nm，发射 波长为460nm。一式三份进行三次独立实验。 活性氧（ROS）活性 A549细胞生长于在35毫米培养皿中的盖玻片并用5μ处理米 FZ或10μ 米 4小时MG132。在药物前2小时加入NAC（10m M）。为了测量活性氧物种的，处理后，将细胞洗涤 并在37℃温育1μ 中号 DCF-DA在无血清培养基不含酚红1个小时。洗涤两次后，用100瓦汞灯照 射样品，用尼康荧光显微镜上的FITC滤光片观察，观察DCFDA荧光。对于定量分析，在Victor 3X荧光计（PerkinElmer Life Sciences）中在485nm激发后，在530nm处测量荧光强度。 报告分析p53和NFκB基因转录 通过分别使用pWWP-Luc（27）或NFκB-Luc构建体的荧光素酶测定法测量FZ对p53-和NFκB-依赖性报道基因转录的影响。对于p53转录活性，在96孔板中用 pWWP-luc和pCMV载体或pCMV-p53（WT）共转染H1299细胞。根据制造商的方案使用 Lipofectamine 2000（Invitrogen）进行转染。24小时后转染，细胞未处理或者用1μ处理米 FZ 24 小时。类似地，对于NFκB报道分子测定，用携带NFκB结合位点和pRL-SV40的NFκB-Luc载体 共转染A549细胞。次日，将细胞用5μ处理米FZ为4小时，然后是30ng /mlTNFα1小时，如图所 示。在两种情况下，然后制备细胞提取物，并使用来自Promega的Dual Luciferase测定试剂盒按 照制造商的说明监测荧光素酶活性。使用96孔荧光板读数器（PerkinElmer Life Sciences Multilabel reader Victor X3）测定荧光素酶活性。pRL-SV40 Renilla载体在所有情况下用于共转染以使数据标准化，并且其以较低浓度转染（比报告荧光素酶质粒低5倍）。数据表示为相对荧 光素酶活性（萤火虫与Renilla值的比率）。实验一式三份进行。 统计分析 除非另有说明，否则所有结果均表示为平均值±SD。学生t检验用于计算显着性，接受p<0.05作为显着性水平。 结果FZ 抑制人非小细胞肺癌细胞的生长并诱导细胞凋亡 为了检查FZ对细胞生长的影响，将NSCLC细胞系（H460和A549）接种到96孔组织培养板上，并在第二天，将细胞暴露于不同剂量的FZ 48小 时。通过MTT测定确定细胞活力。暴露于药物以剂量依赖的方式（降低细胞的生存力图1）。该IC 50值计算为〜1.2和1.6μ 米分别为H460和A549细胞系。如图所示图1个 Ç，FZ以时间依赖的方式降低了这些细胞的生存力。为了确定更长持续时间的细胞活力，在1ΜM后隔天进行 细胞计数测定7天H460，A549和正常人支气管上皮细胞中的FZ处理（图1，D-E）。尽管H460和 A549细胞暴露于FZ时显示出降低的活力，但该化合物对正常人支气管上皮细胞几乎没有作用。 然后我们比较了FZ与其他已建立的抗癌药物的抗增殖能力。与顺铂和紫杉醇相比，时间依赖性 生长测定的结果清楚地表明FZ是更有效的细胞毒性剂（图 1F）。还将FZ在H460和A549细胞中 的生长抑制作用与食品和药物管理局批准的蛋白酶体抑制剂硼替佐米进行了比较，结果显示两 种化合物的活性相当（补充图1）。有趣的是，当我们以剂量依赖的方式用FZ 处理HCT116 p53+ / +和p53 - / -细胞时，p53 + / +细胞对FZ的敏感性更高，正如相对较高的细胞死亡百分比所揭示的那样（图1） G）。我们还评估了FZ对源自不同肿瘤类型的25种细胞系的抗增殖作用，所述 肿瘤类型例如肺，前列腺，乳腺，子宫颈和结肠，其列于设计用于药物筛选的NCI-60组中。这 些细胞系中的大多数具有大于1ΜM的 IC 50值。然而，在至少7种细胞系中，FZ在1ΜM浓度下诱 导约50％的生长抑制（补充表1）。尽管FZ在NSCLC细胞中引起生长抑制和凋亡，但正常的短 期原代培养物或永生化的正常细胞系相对不受其作用的影响（补充图2）。发现FZ 的IC 50值在 这些正常细胞中比在癌细胞系中高几倍。总之，这些结果表明FZ在癌细胞的情况下充当细胞增 殖的抑制剂，但对正常细胞相对无毒。 NSCLC细胞用FZ的温育导致核缩合和凋亡的核形态的碎片特性（图2，和b）。用Hoechst 33342和PI双重染色细胞以检查它们的核形态和质膜完整性。与对照未处理细胞相比，48小时FZ处理的细胞具有显着数量的凋亡细胞核。其中许多呈现橙红色，是晚期凋亡的特征（图 2A，cd）。用TdT介导的dUTP缺口末端标记系统进一步标记细胞核以验证细胞死亡的细胞凋亡性质。 TUNEL阳性细胞的数目显著观察后48小时治疗FZ（图2），然后将其定量（图2乙Ç）。从处理过的细胞中提取的DNA表现出明显的梯状图案，这是凋亡细胞死亡的特征（图 2D）。
当我们进行流式细胞术分析，结果表明，FZ处理导致细胞在G中积累2 / M细胞周期，随后在分G的百分比的显著增加的阶段1凋亡人口，指示DNA降解的（图2 E）。这可能是由于FZ诱导的 G 2 / M检查点调节分子的稳定化，这有助于增强细胞毒性。细胞周期延迟G 2 / M可能是由于CDK2磷酸化的加速和延长以及细胞周期蛋白B1，p53和p21的稳定，这些都与G 2 / M检查点的 控制有关（28）。CDK2激酶的磷酸化状态控制Cdc2-细胞周期蛋白B1复合物的活性，其负责有 丝分裂的发生。因此，通过蛋白质印迹分析进一步检查参与G 2 / M转换的蛋白质水平。 FZ处理对p53蛋白稳定性的影响 因为我们早期的结果表明p53可能在使细胞对FZ诱导的细胞凋亡敏感中起作用，我们在FZ处理后对p53进行蛋白质印迹和免疫荧光实验。图3（）示出的p53水平24和显着增加在两个H460和A549细胞FZ处理后48个小时与对照未处理的细胞相比，免疫荧光在H460细胞中p53清楚地表明在处理的细胞的细胞核的蛋白质的增加的积累（图3（II））。为了确定FZ诱导的p53活化的动力学，我们研究了与1μ处理后的依赖于时间的响应米FZ，如图图3（iii）。在处理后2小时观察到p53诱导，并在24小时达到平台期。接下来我们继续检查这种蛋白质水平的增加是否是转录上调的结果。为此，在FZ处理24或48小时后，从对照 和处理的细胞中分离总RNA。我们使用逆转录酶PCR来分析p53基因表达。结果表明，FZ处理 细胞中p53蛋白的积累并未伴随其mRNA水平的相应增加（图 3B（i）），这通过实时PCR证实（图 3B（ii））。由于未发现p53在转录水平上被FZ上调，这些结果促使我们进一步研究导致其在细胞中积累的事件。我们推测这可能是由于抑制降解途径，并且蛋白酶体介导的蛋白水 解步骤的阻断可能是这种稳定性的原因。有了这个基本原理，重复上述实验，有趣的是，在使 用p53抗体进行蛋白质印迹的较长时间曝光后，我们可以清楚地检测到FZ处理后野生型（WT） p53泛素化形式的显着增加，如对应于蛋白质（的泛素化形式更高分子量条带图3 ç）。 。。。。。。。。。。。。。。。 。。。。。。。。。。。。。。。。。 。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。 中间部分图片太多难以编辑，对试验感兴趣的可以上网搜索或直接联系我们查看原文，下面直接上结论 。。。。。。。。。。 讨论FZ属于一类广谱驱虫药，苯并咪唑类，具有高治疗指数。苯并咪唑作为有效驱虫剂成功的关键 因素可归因于它们对蠕虫的选择性毒性和对正常人细胞的高度安全性。由于其结构的改进或通 过在代谢和哺乳动物和目标寄生虫（之间的差异解毒途径由苯并咪唑寄生微管蛋白的选择性靶 向：该先前已两种不同现象的基础上，说明10 - 12，38）。早些时候，一些属于这一类的化合 物已被证明可作为有效的抗肿瘤药物，尽管分子机制仍然难以捉摸。在本研究中，我们显示芬 苯达唑可作为生长抑制剂，并在人肺癌细胞系中引起凋亡细胞死亡。 适当的靶向蛋白水解对细胞功能和体内平衡至关重要。在真核细胞中，泛素蛋白酶体途径是蛋 白质降解的中心非溶酶体途径（39）。绝大多数蛋白质被泛素 - 蛋白酶体系统选择性地降解， 这反过来又使细胞的存在变得至关重要。泛素化底物和降解的动态平衡在细胞周期进展和细胞 存活（一个重要的角色39，40）。因此，不言而喻，该途径的功能障碍将促进细胞死亡。可以 预见，已经发现蛋白酶体功能的药理学抑制诱导双重凋亡信号传导途径，这取决于特定的细胞 环境，并且各种蛋白酶体抑制剂已被推向治疗应用，硼替佐米（Velcade）是第一个临床批准的 小分子蛋白酶体抑制剂（41）。然而，据报道硼替佐米在非小细胞肺癌来源的异种移植小鼠模 型中没有抗肿瘤活性（3）。硼替佐米后，几种第二代蛋白酶体靶向药物如NPI- 0052（salinosporamide A），MLN9708，CEP18770（第一阶段），argyrin A，和卡非佐米（第 三阶段）已进入临床试验（1，41 - 45）。我们的结果表明，FZ作为蛋白酶体功能的抑制剂，并 通过激活线粒体途径导致细胞死亡。 首先，我们已经证明暴露于FZ会抑制细胞蛋白酶体功能的剂量和时间依赖性，并导致各种细胞 蛋白质（包括p53）的泛素化衍生物的积累，而这反过来又通过线粒体途径导致细胞凋亡。通过 抑制不稳定的增强的绿色荧光蛋白，蛋白酶体的模型底物以及蛋白酶体如IκBα，p53和细胞周 期蛋白B1的各种其他细胞底物的降解进一步证实了这一点。最后，我们已经证明FZ处理导致线粒体膜电位的变化，细胞色素c释放从线粒体进入胞质溶胶，并激活下游半胱天冬酶，然后进行PARP裂解。然而，广谱半胱酶抑制剂Z-VAD-FMK基本上没有从FZ诱导的细胞死亡中拯救细胞，这表明存在替代的，不依赖半胱天冬酶的机制，其有助于FZ的细胞杀伤作用。 我们的结果显示，响应FZ处理，细胞首先经历G 2 / M停滞然后凋亡。先前已报道p53活化是由 蛋白酶体抑制剂引起的细胞死亡的关键事件（46）。因为FZ处理导致p53的显着诱导和其靶基 因的相应上调，这可能有助于通过线粒体途径经历细胞死亡的细胞。因此，FZ诱导的蛋白酶体 功能障碍可间接导致线粒体细胞色素c释放。除了p53和其靶基因，蛋白酶体抑制也可调节细胞 凋亡途径中以及在细胞生长和存活途径（牵连其他蛋白质的表达47，48）。各种细胞蛋白降解 的这种改变将导致它们的表达水平的变化，这反过来可能影响细胞存活并促进细胞凋亡。此 外，我们还报道了FZ处理后NFκB转录活性的抑制。这可能归因于IκBα的稳定性和半衰期的增 加，已知IκBα抑制NFκB细胞存活途径。我们提供证据表明FZ诱导的蛋白酶体功能障碍可阻止 IκBα的降解，从而阻断NFκB的核转位和反式激活。在这种情况下，可以指出的是，NFκB途 径，其可以保护细胞免受氧化应激中发挥关键作用，已知通过蛋白酶体抑制剂（被禁用49， 50）。FZ诱导的ROS产生可能与ROS相关基因的转录激活有关。我们的数据显示FZ处理后的PIG3诱 导。PIG3是氧化还原酶的p53诱导基因同源物，据报道它与p53诱导的ROS产生的升高有关（51）。蛋白酶体抑制可能会累积线粒体损伤并在细胞内产生氧化应激（52）。反过来，氧化应激可以 通过产生过量水平的受损蛋白质，引起未折叠的蛋白质反应或通过降低ATP产生水平来影响蛋 白酶体功能。蛋白酶体抑制剂之前已经报道引发ER应激反应（53，54）。某些化合物通过ER 应力-ROS诱导选择性地杀死癌细胞，因为癌细胞被预期对ROS应力响应途径强烈依赖与正常细 胞（比较55 - 58）。总之，我们的结果表明FZ通过蛋白酶体功能的损伤和诱导的未折叠蛋白反 应诱导癌细胞中的细胞毒性。 泛素 - 蛋白酶体系统是细胞蛋白质稳态的组成部分。越来越多的人认识到这种途径对正常细胞 功能和疾病的根本重要性已经促使人们深入研究选择性阻断这些途径功能的小分子抑制剂。因此，我们提出FZ作为靶向泛素 - 蛋白酶体途径并有效杀死癌细胞的新型候选药物。 FZ的作为抗肿瘤剂的功效，正在研究。 |
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