补肾活血汤对骨关节炎大鼠软骨修复的影响

11jiuge 2022-06-30 发布于山东

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【摘要】目的：探讨补肾活血汤对骨关节炎大鼠软骨修复的影响。方法：将40只雄性SD大鼠随机分为5组，即正常组、模型组、补肾活血汤高低剂量组及硫酸氨基葡萄糖阳性对照组，每组8只;采用木瓜蛋白酶关节注射法建立SD大鼠OA模型;末次给药后取大鼠血清、关节炎、软骨组织;免疫吸附法（ELISA）法检测血清及关节液中MMP-13，TNF-α及COMP的含量。结果：将OA模型组与正常对照组相比较，模型组血清及关节液中的炎性因子（MMP-13，TNF-α、COMP）均大幅度增加（P<0.05），与OA模型组相比补肾活血汤高低剂量组大鼠血清及关节液中MMP-13，TNF-α及COMP的含量明显下降（P<0.05）。结论：六味骨痹汤可促进大鼠OA模型软骨修复，其机制可能是通过降低大鼠血清和关节液中MMP-13，TNF-α等因子含量抑制软骨破坏有关。

【关键词】补肾活血汤;骨关节炎;软骨修复;炎症因子

本实验通过观察对OA模型大鼠灌胃使用临床常用方剂——补肾活血汤，对其有关的炎性因子的抑制水平，从而进一步探究其修复关节软骨的能力及其对应机制。

1 一般资料

1.1 实验动物

28天的清洁级SD大鼠（体重：79±10g），共40只，来源：延边大学医学院-实验动物中心，合格证号为SCXK（吉）2016-007，常温饲养，自由进食水，适应性喂养1周。

1.2 实验药物及制备

熟地黃（20g）、菟丝子（20g）、补骨脂（20g）、杜仲（6g）、枸杞子（6g）、肉苁蓉（6g）、山萸（6g）、独活（6g）、没药（6g）、当归（6g）、红花（3g）（均由长白山保护开发中心医院药房提供），将全部药品使用粉碎机打碎成粉，使用乙醇水溶液（浓度为75%）进行提取，每次2h，反复进行5次，对提取液进行回收，并提取乙醇将其制成冻干粉，使用医用生理盐水将其溶解制成药液（浓度200mg/mL）。

1.3 药品及试剂

硫酸氨基葡萄糖胶囊（信东生技股份有限公司）。木瓜蛋白酶（上海鑫乐生物科技有限公司），TNF-α、MMP-3、COMP酶联免疫试剂盒购于Sigma公司（美国）。

1.4 实验仪器

H1650-W型台式离心机（美国Therom公司）;酶联免疫检测仪（RT-2100C，美国）;BK46型显微镜（日本奥林巴斯公司）。

2 方法

2.1 动物分组与OA模型制备

将40只雄性SD大鼠适应性喂养1周，随机随机分为5组，即正常组、模型组、补肾活血汤高低剂量组及阳性对照组，每组8只。将OA模型组，补肾活血汤高低剂量组以及阳性对照组小鼠右膝关节注射使用木瓜蛋白酶进行模型制备。

2.2 治疗

参考实验药理学中人体与实验动物用药剂量比值对本次使用的汤剂进行相应换算，按比例使用生理盐水对药品进行稀释溶解，补肾活血汤高低剂量组剂量分别为1mL/只、0.5mL/只，阳性对照组予药物1mL/只;不进行药物干预的正常组与OA模型组按1mL/只的剂量使用生理盐水进行灌胃，为期4周。

2.3 标本的制备方法

灌胃结束后，麻醉全部大鼠，将大鼠于固定板上固定，剪断其尾部，用一次性注射器采集5ml血液，处死大鼠后对造模关节处实施剃毛消毒处理，对其注射生理盐水（1mL）并充分活动关节，回收冲洗液（不少于6mL）于1.5mL的Tube管内使用4度离心机离心收集上清液，-80℃冰箱保存。

2.4 细胞因子的检测

使用相应试剂盒检测样本上清液中MMP-13，TNF-α及COMP的含量，其步骤应严格按照试剂盒说明书[9]。使用相关软件绘制标准曲线并计算炎性因子的含量。

2.5 统计学方法

SPSS17.0软件进行相应的数据处理。全部计量资料以表示，两组间差异用t检验，使用单因素方差分析确定多组间比较，当P<0.05时有统计学意义。

3 结果

3.1 血清及关节液中炎性细胞因子含量

与正常组相比OA模型组血清及关节炎中MMP-13，TNF-α及COMP的数值表达增高（P<0.05）;与模型中相比经药物治疗后的大鼠血清及关节炎MMP-13，TNF-α及COMP水平下降（P<0.05）（表1表2）。

4 讨论

OA属于中医学“骨痹”“痹症”范畴，补肾活血汤出自清代赵竹泉的《伤科大成》，活血通络止痛，补调肝肾，强筋壮骨，可从根本上治疗本病[7-9]。本研究是通过观察补肾活血汤对大鼠血清及关节炎中MMP-13，TNF-α及COMP含量影响，进一步评价该汤剂对OA大鼠变态反应的治疗效果。

目前OA的发病机制尚不明确，多数研究者认为其发生是关节软骨细胞及细胞外基质、软骨下骨质三者降解与合成失衡的结果[10-12]。研究发现多种因子在OA的发生发展中起重要作用，可作为反映关节软骨损伤或修复的标志。其中TNF-α与多种疾病的发生有关，免疫性疾病TNF-α水平明显增高，与膝骨关节炎滑膜炎病变和软骨退变密切相关，它可提高MMP-13 的基因表达，特异性降解Ⅱ型胶原纤维，从而破坏软骨结构[13]。除此之外，关节软骨受到损伤时COMP会从软骨释放到关节液并吸收入血，故关节液及血清中COMP的含量也可反映反映软骨的破坏程度[11]。

本研究发现应用不同剂量的补肾活血汤干预后，较模型组相比补肾活血汤组大鼠血清及关节液中炎性细胞计数MMP-13，TNF-α及COMP水平下降，说明补肾活血汤缓解了OA大鼠关节的炎性反应。故推测麻黄发表汤是通过减轻MMP-13，TNF-α及COMP水平，从而达到治疗OA的目的。

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