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文章信息 题目：Overexpression of MsRCI2A, MsRCI2B, and MsRCI2C in Alfalfa (Medicago sativa L.) Provides Different Extents of Enhanced Alkali and Salt Tolerance Due to Functional Specialization of MsRCI2s 刊名：Frontiers in Plant Science 作者：Hua Cai et al. 单位：Northeast Agricultural University 日期：19 August 2021 摘要 1 冷诱导质膜蛋白 (RCI2/PMP3 ) 基因在植物中普遍存在，属于多基因家族，其成员通过调节离子稳态和稳定膜结构来应对各种非生物胁迫，从而防止损伤。本研究分析了高盐、碱和ABA处理下MsRCI2A、MsRCI2B和MsRCI2C的表达。结果表明：盐、碱和ABA处理诱导紫花苜蓿（Medicago sativa L.）中MsRCI2A、MsRCI2B和MsRCI2C的表达，但MsRCI2的表达存在差异。不同处理下的基因表达。我们通过生成在CaMV35S启动子控制下表达这些MsRCI2的转基因紫花苜蓿植物，研究了紫花苜蓿 (Medicago sativa L.)中 MsRCI2A、MsRCI2B 和 MsRCI2C 蛋白的功能差异。在高盐胁迫和弱碱胁迫下，过表达MsRCI2A/B/C的植物表现出不同程度的改善表型。盐胁迫对紫花苜蓿的影响比碱胁迫更为显着。MsRCI2的过表达苜蓿中对盐胁迫产生了相同的生理反应。然而，在响应碱胁迫方面，MsRCI2s编码的三种蛋白质表现出功能差异。 技术路线 2
主要结果 3 3.1 序列分析 根据已知的MsRCI2A（JQ665271）、MsRCI2B（Medtr7g111450）和MsRCI2C（Medtr7g111350）核酸序列，克隆了水稻的MsRCI2基因。之后，对3个MsRCI2和所有查询的拟南芥和苜蓿RCI2基因成员进行序列比对以鉴定保守区域/序列。RCI2基因成员高度同源，均具有PMP3蛋白特征。与其他PMP3蛋白类似，由MsRCI2编码的蛋白预测有两个跨膜结构域。通过邻接法构建基于氨基酸序列的系统发育树。结果表明，MsRCI2A、MsRCI2B和MsRCI2C聚集成一个保守分支，与AtRCI2E同源。此外，MsRCI2A / MtRCI2A、MsRCI2B / MtRCI2B和MsRCI2C / MtRCI2C作为基因对出现，表明它们具有高度的序列同源性。 3.2 非生物胁迫下MsRCI2A、MsRCI2B和MsRCI2C基因的表达 如图1所示，MsRCI2A、MsRCI2B和MsRCI2C基因在碱和盐胁迫下表现出不同的表达模式，相同的基因在根和叶中表达存在差异。在 100 mmol·L –1 NaHCO3 (图 1A )处理下，叶片中MsRCI2基因的表达在早期（1 或 2 小时）开始显着上调，在 5-24 小时下调，之后在 48 小时表达增加。在根中，在100 mmol.L –1 NaHCO 3下， MsRCI2基因的表达变化比叶片更显着；此外，这些基因的表达水平不断增加，均在48 h达到峰值。根中MsRCI2A基因的表达水平明显高于MsRCI2B和MsRCI2C基因。在 200 mmol·L –1 NaHCO 3 (图 1B ) 处理后，MsRCI2的表达基因在 2 h 上调，在 5 h 下调，其表达在 48 h 达到显着最高水平。然而，在盐胁迫下（图1C），MsRCI2基因的表达在碱胁迫下差异最大。以上结果表明MsRCI2A、MsRCI2B和MsRCI2C基因对碱盐胁迫有不同程度的响应。
3.2 碱、盐胁迫下苜蓿转基因MsRCI2基因的变化 过表达MsRCI2A、MsRCI2B或MsRCI2C的紫花苜蓿在碱和盐胁迫下的表型变化如图2所示。未经处理的 A12、A22、B13、B19、C2 和 C10 植物与 WT 植物之间的表型、叶绿素含量或相对电解质泄漏没有显着差异。这意味着MsRCI2基因的过表达不会改变紫花苜蓿的生长。用 100 mmol·L –1 NaHCO 3 (pH 8.5) 或 200 mmol·L–1 NaCl处理 12 天后，WT植物的整体生长受到抑制，植物几乎死亡。WT植株的叶绿素含量在碱胁迫和高盐胁迫后分别明显下降48.7%和75%。盐胁迫后转基因植物中的叶绿素含量略有下降，但碱胁迫后没有变化（图2B）。胁迫处理后，WT和转基因植物的相对电解质泄漏增加（图2C)，而野生型植物的增长率明显高于每种转基因植物，尤其是在盐胁迫下。综合以上结果，过表达MsRCI2基因可导致紫花苜蓿对盐碱胁迫均不敏感，但胁迫处理后叶绿素含量和相对电导率无明显变化。
3.3 碱、盐胁迫下MsRCI2转基因紫花苜蓿抗氧化能力的变化 在正常情况下，几种转基因植物和野生型植物的SOD、POD和CAT活性存在显着差异。碱处理后转基因植株的SOD酶活性变化不大：A12和A22活性增加，B13和B19活性降低，C2和C10活性没有变化。碱胁迫 12 天后，仅 A12 和 A22 的 SOD 活性高于 WT（图 3B）。 如图 3C所示，A12、B13、B19、C2 和 C10 的 POD 活性显着高于未处理的 WT，尤其是 C2 和 C10。有趣的是，碱处理6天后，WT植物B13、B19和C10的POD活性没有明显变化；而A12和A22显着增加，C2显着降低。碱处理 12 d 后，A12、A22、C10 的 POD 活性显着降低，仅 B13 和 B19 的 POD 活性显着高于其他基因型。上述结果表明，与其他植物相比，B13和B19植物在碱胁迫下的POD活性持续时间更长，与A12和A22相比，其响应更快。正常情况下B13和C2的CAT活性与其他基因型相比存在显着差异。碱处理后第 12 天 B13 和 C2 中的 CAT 活性下降到与 WT 相同的水平（图 3D）。 对于盐分胁迫，如图 3F-H所示，各转基因植株 SOD、POD 和 CAT 的活性增加，而 WT 的抗氧化能力仅在第 12 天略有增加。从SOD、POD和CAT酶活性的变化可以看出，在盐胁迫下，每株转基因植物的SOD活性都高于WT，并且具有更强的去除活性氧（ROS）的能力。此外，在盐胁迫反应过程中，三种 MsRCI2A、MsRCI2B 和 MsRCI2C 蛋白具有相似的功能。
3.4 碱胁迫下转基因紫花苜蓿植物胁迫响应基因表达的变化 为了进一步探索转基因植物中碱胁迫相关基因表达的变化，分析了H +-ATPase基因的表达水平（图5A）。用 100 mmol·L –1 NaHCO 3 (pH 8.5) 处理 12 h 后，除 C10 基因型外，WT 和转基因植物中H + -ATPase基因的表达没有差异。 MsRCI2A、MsRCI2B和MsRCI2C具有高度同源性，均以不同程度的表达对胁迫响应，表现为不同转基因植物之间生理指标的差异，尤其是在碱胁迫下。因此，分析了碱胁迫下每个转基因植物中RCI2基因的表达（图 5B-D）。碱处理12 h后，B13和B19细胞中MsRCI2A基因的表达略有抑制，而C2和C10细胞中MsRCI2A基因的表达上调（图5B）。对于MsRCI2B，在 C2 和 C10 中的表达与 WT 中的表达没有差异，而在 A12 和 A22 中，表达下调（图 5C）。此外，MsRCI2C基因在A12、A22、B13和B19细胞中的表达被显着抑制（图5D）。这意味着MsRCI2A、MsRCI2B和MsRCI2C在碱胁迫反应中存在潜在的调节关系，并且它们的功能是非冗余的。
结论 4 盐、碱和ABA处理均诱导MsRCI2A、MsRCI2B和MsRCI2C的表达，但不同处理下MsRCI2基因的表达存在差异。MsRCI2A、MsRCI2B和MsRCI2C的过表达可以提高紫花苜蓿的耐碱耐盐性。苜蓿中MsRCI2的过表达对盐胁迫产生了相同的生理反应。然而，为了应对碱胁迫，研究的三种由MsRCI2s编码的蛋白质表现出功能差异，这不仅取决于它们不同的转录模式，还取决于它们与 H + -ATPase 或其他 MsRCI2 的调节关系的差异。 原文获取 5 原文链接： |
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