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摘要：在过去的十年里，全球药物研发机构对mRNA疫苗的研究和开发取得了巨大的进展，这一领域的工作受到了快速开发疫苗的迫切需要的刺激，以应对当前COVID-19大流行等紧急疾病。然而，我们对mRNA疫苗的作用机制以及它们在安全性和有效性等领域的长期表现的了解仍存在差距。本文综述了mRNA预防疫苗的开发技术和工艺，疫苗的发展现状，并对mRNA疫苗引起的免疫应答进行了讨论。它还讨论了从监管角度评价mRNA疫苗的重要问题。为包括疫苗在内的生物制品制定全球规范和标准，以确保其质量、安全性和有效性，是世界卫生组织70多年来的一项任务和核心职能。世界卫生组织正在采取新的行动，以达成广泛共识，制定关于mRNA疫苗的生产和质量控制以及非临床和临床评价的国际指南，这对于促进国际生产和监管做法的趋同，并为世界卫生组织成员国的国家监管当局提供支持是必要的。 许多候选mRNA已经进入临床试验，用于各种各样的应用，如病毒性疾病的预防和各种癌症的免疫治疗。由于各种原因，新出现的传染病成为这项新技术的有力目标，其中包括当面对新发现的病原体时，它们可以迅速被制造出来。因此，临床试验的候选目标包括流感病毒(H7N9和H10N8)和Zika病毒，以及最近最紧急的COVID-19病原体SARS-CoV-2。候选预防疫苗使用脂质纳米颗粒(LNPs)合成的mRNA。表1列出了使用mRNA预防性疫苗预防传染病的临床试验清单。SARS-CoV-2引起的大流行的开始导致了通过多种不同技术开发COVID-19疫苗的大规模努力；由于mRNA候选疫苗的设计和生产速度快，它们是首批进入临床试验的COVID-19疫苗之一。事实上，最先进的mRNA候选疫苗是COVID-19疫苗，包括3期临床试验(见表2)。 
《WHO研发蓝图》是一项全球战略和防范计划，可快速启动研发活动。为了制定《研发蓝图》，世界卫生组织开发了一种特殊工具，用于确定在突发公共卫生事件(PHE)背景下应优先考虑哪些疾病和病原体进行研发。目前，优先关注的疾病有:COVID-19、克里米亚-刚果出血热、埃博拉病毒病和马尔堡病毒病、拉沙热、中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)和严重急性呼吸综合征(SARS)、尼帕病毒和亨尼帕病毒病、裂谷热、寨卡病毒、“X病”。“疾病X”表示认识到目前未知的导致人类疾病的病原体可能导致严重的国际流行病。《研发蓝图》明确寻求尽早开展与未知“X疾病”相关的跨领域研发准备工作。这不是一个详尽的清单，也没有指出下一次流行病最有可能的原因。世界卫生组织根据需要和方法的变化对这份清单进行审查和更新。然后，世界卫生组织根据重点疾病制定每一种疾病的研发路线图。 世界卫生组织总干事于2020年1月宣布，2019冠状病毒病(COVID-19)已成为“国际关注的突发公共卫生事件”(Pub)，并评价称，到2020年3月，2019冠状病毒病可被定性为大流行。mRNA疫苗是COVID-19大流行期间首批进入临床开发的候选疫苗之一，预计将成为首批获得许可的疫苗。两种mRNA疫苗在3期临床试验中显示了约95%的有效性，最近已被一些国家的国家监管当局批准用于紧急用途，以抗击大流行。2020年12月31日，世界卫生组织将COVID-19 mRNA疫苗列入紧急用途，使辉瑞/BioNTech疫苗成为首个获得世界卫生组织紧急验证的疫苗。预计mRNA疫苗将成为一种平台技术，为在PHE中快速开发抗优先病原体感染的疫苗提供潜力。本文介绍信使RNA (mRNA)疫苗的研究现状。会议还讨论了世界卫生组织通过制定标准在全球一级改善监管趋同方面的作用，因为促进监管趋同在《研发蓝图》中被认为是一个关键推动因素。 mRNA作为一种潜在的体内基因传递技术的应用于1990年发表，当时直接注射“裸”mRNA被证明能够导致编码蛋白的体内表达。然而，各种问题阻碍了直接使用体外转录的mRNA作为一种简单注射后在体内生成蛋白免疫原的便捷手段的能力。这包括mRNA在体内的不稳定性，这是由于核糖核酸酶几乎无处不在。此外，该mRNA具有很强的免疫原性，刺激先天反应，同时降低了mRNA的翻译。虽然先天免疫反应可能有利于mRNA的疫苗应用，但其稳定性和因此产生的mRNA的挑战仍然存在。Karikó和Weissman发现，使用修饰过的核苷会降低体外转录的mRNA的免疫刺激作用，这是一项重大进展，导致了使用mRNA作为平台技术的努力迅速扩大。通过toll样受体(TLR)刺激的减少(详见下文第3节)。他们继续表明，通过使用假尿嘧啶代替尿嘧啶，得到的mRNA也更稳定，翻译能力也提高了。Schlake和同事的进一步研究使mRNA的产生成为可能，这种mRNA同样不会刺激先天反应，而且仅通过序列工程就避免了蛋白质产生的减少，而不需要对核苷进行修饰。配方(主要是LNPs)的开发也至关重要，它有助于稳定mRNA，并促进其进入细胞和从核内体释放(可能作为编码蛋白的佐剂)。LNPs由各种脂质组成，通常包括磷脂、胆固醇、离子脂质和聚乙二醇偶联脂质，形成一个水中心，带电的mRNA分子位于水中心。Reichmuth和同事进一步描述，mRNA因此受到保护，脂质颗粒便于进入细胞，甚至从溶酶体中释放mRNA。制造商有他们自己的专利LNP，不同的特点和制造方法。由于将开发新的LNP配方(如一家制造商目前正在做的提高热稳定性)，并且由于实际成分(如每个成分的百分比)和制造工艺是专有的，这些信息超出了本手稿的范围。需要注意的是，虽然大多数使用mRNA技术的候选疫苗的重点是抗体反应，但T细胞反应也显示由mRNA疫苗产生。这些细胞包括CD4 T辅助细胞，它们是最佳抗体反应所必需的。T细胞在疫苗疗效评估中的作用可能很难确定(就免疫的任何相关性而言)，因为目前还没有开发出完全基于T细胞反应的疫苗。然而，这两种类型的T细胞在产生抗体反应(T细胞帮助)和杀死病毒感染细胞(细胞溶解T淋巴细胞)方面的作用为mRNA疫苗添加了额外的免疫臂。例如，抗SARS-病毒-2 T细胞可能很重要，因为中和抗体会随着时间的推移而减弱。另一种类型的mRNA疫苗被称为自扩增RNA疫苗，这种疫苗的早期版本已经用质粒DNA疫苗和病毒载体制成并进行了临床前研究综述)。自扩增mRNA (SamRNA)疫苗对来自不同病毒(如甲病毒)而非目标病毒的所需抗原和关键病毒复制子蛋白进行编码。由信使RNA编码的阿尔法病毒复制子的产生，导致被转导的细胞能够产生许多抗原信使RNA的副本，因此，比通常每个编码抗原的信使RNA分子所产生的蛋白质抗原要多得多。因为mRNA只编码抗原和特定的复制子蛋白质，所以这一过程不需要制造整个病毒。由于需要制造更多的蛋白质抗原副本，这种自我扩增的mRNA疫苗可能更有效，可能不需要加强剂量。对于COVID-19疫苗，人们狂热的采用mRNA，一个重要原因是，候选疫苗的生成速度非常快，因为mRNA结构可以在了解病原体的基因序列和目标抗原的基础上生成。另一个感兴趣的原因是，制造过程基本上是mRNA疫苗的通用过程，独立于疫苗编码的抗原。制造过程包括包含mRNA序列的DNA模板的体外转录。这个信使RNA标准元素,比如5’翻译区(UTR),起始密码子和一个开放阅读框(ORF),一个终止密码子,后跟一个3’UTR和聚(a)序列(见图1),并经常为表达式优化的RNA(密码子优化,优化翻译和稳定性已使用)。mRNA被帽化和聚腺苷化，以实现高效翻译。该帽可以在转录过程中或转录后添加;poly(A)序列可以在转录过程中加入，也可以在转录后与poly(A)聚合酶一起加入。5’和3’UTR的序列对翻译效率有显著影响。
这个工艺从一个线性化的DNA模板开始，一个依赖DNA的RNA聚合酶(通常来自噬菌体T7)利用核苷三磷酸作为构建模块，将模板转录成mRNA。核苷可以是天然核苷，也可以是自然发生的修饰核苷。在mRNA纯化过程中，去除DNA模板、酶和核苷酸是很重要的。不同的制造商已经根据核苷的使用(即，如何修饰，如果修饰)优化了它们的特定结构，序列，最近总结了脂质纳米颗粒配方以实现适当的免疫原性、效力和热稳定性。此外，在临床前和临床研究中，目标是找到最佳的免疫刺激水平，同时由于强大的免疫反应，限制任何临床不良事件(如注射部位疼痛，或系统性症状，如寒颤)。mRNA刺激先天免疫反应，多种细胞通路被激活，包括toll样受体；天然免疫系统的TLR3，TLR7和TLR8，以及通过各种细胞质蛋白，特别是PKR(蛋白激酶R)，RIGI(维甲酸诱导基因I)， OAS(2 -5 -寡腺苷酸合成酶)和MDA5(黑色素瘤分化相关蛋白5)通过细胞质蛋白。虽然使用改良核苷导致mRNA的免疫刺激活性下降，但炎症导致一些不严重的临床不良事件，临床试验报告中描述了这些事件，并导致在两个病例中选择了第二高剂量。疫苗业界和科学界、公共卫生有关人士讨论了将新冠病毒mRNA疫苗的剂量降低到最初三期临床试验评估剂量的可能性。在不影响疫苗效力的情况下，这将大大增加现有剂量的数量。值得注意的是，自我扩增的RNA疫苗通常不是用修饰过的核苷生产的，因为在细胞中扩增的RNA是用未修饰过的核苷合成的。COVID-19疫苗临床试验的快速进展和潜在的全球应用，使世界卫生组织有必要解决mRNA疫苗的相关特点，以评估mRNA对预防疫苗的质量、安全性和有效性。尽管任何特定候选疫苗的某些信息可能是专有的，因此目前还不为人所知，无法制定具体的指导方针，但仍需考虑mRNA固有的免疫和结构特性、交付配方的需要以及制造过程。除了预防性疫苗需要考虑的更一般的问题外，由于严重感染SARS-CoV-2时出现的特异性和千变万化的病理生理表现，COVID-19疫苗可能有一些特定的考虑。其中一个考虑因素是疫苗增强呼吸道疾病(VERD)的可能性，一些针对其他病毒的疫苗已经证明了这一点，而诱导th1型免疫应答的疫苗似乎可以将这种可能性降至最低。图1所示。由线性化的DNA质粒模板制成的mRNA的体外转录过程这个过程从一个线性化的DNA模板开始，一个依赖DNA的RNA聚合酶(通常来自噬菌体T7)利用核苷三磷酸作为构建模块，将模板转录成mRNA。核苷可以是天然核苷或天然发生的修饰核苷。在mRNA纯化过程中，去除DNA模板、酶和核苷酸是很重要的。不同的生产商已经根据所使用的核苷(即，如何修饰，如果修饰)优化了它们的结构，序列，最近总结了脂质纳米颗粒配方以实现适当的免疫原性、效力和热稳定性。此外，在临床前和临床研究中，目标是找到最佳的免疫刺激水平，同时由于强大的免疫反应，限制任何临床不良事件(如注射部位疼痛，或系统性症状，如寒战)。在两个病例中是第二高剂量。疫苗业界和科学界、公共卫生有关人士讨论了将新冠病毒mRNA疫苗的剂量降低到最初三期临床试验评估剂量的可能性。在不影响疫苗效力的情况下，这将大大增加现有剂量的数量。值得注意的是，自我扩增的RNA疫苗通常不是用修饰过的核苷生产的，因为在细胞中扩增的RNA是用未修饰过的核苷合成的。COVID-19疫苗临床试验的快速进展和潜在的全球应用，使世界卫生组织有必要解决mRNA疫苗的相关特点，以评估mRNA对预防疫苗的质量、安全性和有效性。尽管任何特定候选疫苗的某些信息可能是专有的，因此目前还不为人所知，以便制定具体指导方针，但仍需考虑mRNA固有的免疫和结构特性、交付配方的需要以及制造过程。除了预防性疫苗需要考虑的更一般的问题外，还有一些可能是COVID-19疫苗特有的考虑，因为严重感染SARS-CoV-2会出现特异性和千变万化的病理生理表现。其中一个考虑因素是疫苗增强呼吸道疾病(VERD)的可能性，一些针对其他病毒的疫苗已经证明了这一点，而诱导Th1型免疫应答的疫苗似乎可以将这种可能性降至最低。mRNA疫苗所需的许多监管问题与任何疫苗类似，如起始材料的质量、生产的一致性、在临床前研究、临床试验和上市后监测期间证明的安全性和有效性。最近的一些综述讨论了mRNA疫苗的生产、质量控制和安全性的监管问题。然而，由于生产的mRNA疫苗涉及新技术，一些监管方面的考虑是专门针对这类疫苗的。而生产mRNA的过程(或SamRNA)似乎是围绕酶合成RNA的一个线性DNA模板使用噬菌体和络合RNA的RNA聚合酶脂质纳米颗粒,一般流程细节保持私有,不向公众开放。因此，目前还不可能确定评估mRNA疫苗的具体原则。因此，国家监管当局应根据世界卫生组织疫苗评价指南或建议制定监管要求。酶、核苷酸和线性DNA模板的质量和一致性是至关重要的。原料，如脂类，应仔细控制，并证明其纯度。线性DNA模板应根据现行的良好生产规范(cGMP)生成，尽管在疫苗开发的早期阶段，这可能不是必要的。一些重要的注意事项药物物质的纯度是RNA,与全长转录本的比例、短转录本和双链RNA的数量，以及被帽化和聚腺苷化的mRNA的百分比，都是监测的关键参数。对于药品，无论如何生产，量化颗粒中包裹的mRNA的数量，并确定颗粒的大小分布是很重要的，这用于监控生产的一致性。通常需要监测的参数包括稳定性、身份和无菌性。mRNA疫苗的热稳定性是疫苗开发者、监管部门和使用者面临的挑战之一。冷链要求被认为是使用mRNA疫苗的限制之一，特别是在低收入和中等收入国家，在这些国家可能难以确保通过冷链运输和储存疫苗。确定该平台效力的检测方法正在开发中，应与国家监管机构进行讨论。但是，从药物产品中提取的mRNA的细胞自由转译、用药物产品转染培养细胞和用某些免疫学方法检测抗原是确定mRNA编码所需抗原的两种常用方法。在动物研究和人类临床试验的背景下，监测全身和局部毒性和炎症反应是预期的。如有必要，可能需要考虑降低剂量。除了已证实的mRNA疫苗问题外，监管机构还需要解决一些看法。新的生产技术通常会对新产品的安全性提出一些问题。其中一个担忧是与RNA整合到人类DNA的潜在风险有关。应该指出的是，虽然对于质粒DNA疫苗与宿主基因组的整合存在理论上的担忧，但基于mRNA的疫苗却没有这种担忧，原因如下：(1) mRNA停留在细胞质中，不被转运到细胞核。(2)为了整合，mRNA可能需要转化为DNA分子。虽然单链DNA有可能被整合，但DNA的整合形式一般为双链DNA。这需要逆转录酶的存在以及mRNA上适当的引物和互补的结合位点，首先生成单链DNA，然后将单链DNA转化为双链DNA，这同样需要适当的引物和结合位点。在逆转录病毒中，这个过程发生在逆转录病毒颗粒中。mRNA疫苗的情况并非如此，因为虽然哺乳动物细胞中存在内源性逆转录酶，但是酶和RNA在适当的复合体中无法被发现，从而无法进行有效的逆转录。(3)逆转录病毒整合的最后一步需要病毒整合酶的活性，而病毒整合酶也在逆转录病毒颗粒中。裸双链DNA的整合已经被证明是非常低效的。(4)疫苗mRNA已被证明一旦被人体细胞吸收，在相对较短的时间内降解。最后，由于细胞mRNA比mRNA疫苗更丰富，细胞逆转录酶(RT)不太可能优先复制疫苗mRNA而不是细胞mRNA。由于所有这些原因，mRNA疫苗的整合风险被认为可以忽略。监管评估和制定标准作为世界卫生组织任务的一部分，世界卫生组织在支持其194个成员国的监管当局方面发挥着独特的作用。世界卫生组织的核心职能之一是制定规范和标准并促进和监测其实施。70多年来，生物标准化专家委员会(ECBS)一直积极建立世界卫生组织生物制品标准。世界卫生组织标准，无论是书面的还是测量的，都以科学证据为基础，并为建立和更新国家监管要求提供了基础。它们还提供了全球视角，并发表在《世界卫生组织技术报告丛书》中。关于生物物质的国际建议或准则的作用是确保提供质量、安全和有效有保证的疫苗，用于国际免疫规划。此外，这些文件作为产品全球可接受性的基准标志，并作为定义国家许可证管理要求以及许可证后评估的基础。这些活动包括疫苗、生物治疗产品和其他生物制品的测量(物理标准)和书面标准，旨在为国家监管当局和制造商提供指导。测量标准的制定涉及到在世界各地众多实验室的精心合作对比研究，世界卫生组织的书面标准是基于通过大量国际磋商达成的科学共识。这项工作得到了世界卫生组织合作中心、许多国家的国家监管当局、药典、制造商协会和学术界的支持。作为COVID-19测量标准的例子，世界卫生组织欧洲委员会于2020年12月10日制定了第一份指定单位为250iu /安瓿(中和抗体活性)的世界卫生组织抗SARS-CoV-2免疫球蛋白国际标准和第一份世界卫生组织抗SARS-CoV-2免疫球蛋白国际参考小组。这些标准旨在作为全球标准试剂，国家标准制剂将参照这些标准进行校准。对照单一全球标准校准国家参考文献将有助于比较在不同国家进行的测定结果(例如，对COVID-19候选疫苗的抗体反应)。通过合作研究，这些试剂的开发和科学评估已在创纪录的时间内完成，标准已于2020年12月底由英国国家生物标准化和控制研究所世界卫生组织合作中心提供。预期这些标准的使用将有助于更好地了解免疫反应，特别是保护的相关性，这对免疫接种的成功至关重要。世界卫生组织还在实施新准则和建议方面发挥重要作用，这些准则和建议也可作为全球监管趋同的工具。关于世界卫生组织生物制品国际标准的详细信息可在世界卫生组织生物制品网站上找到。此外，世界卫生组织还采取了其他与疫苗标准化密切相关的行动。特别是，加强国家监管当局是确保全世界疫苗质量的重要因素之一。疫苗资格预审是世界卫生组织(WHO)通过资格预审的疫苗成为联合国儿童基金会(UNICEF)供应对象的重要机制。疫苗的安全性和世界卫生组织疫苗安全全球咨询委员会讨论的问题，以及由战略咨询专家组领导的世界卫生组织与免疫政策有关的活动也很重要。在所有这些活动的背景下，需要将mRNA疫苗视为对控制SARS-CoV-2造成的大流行至关重要的新免疫工具，并期望利用该技术生产的疫苗也将在控制其他疾病方面发挥作用。鉴于mRNA疫苗的发展以及所面临的科学和监管方面的挑战，认为有必要就开发和评价mRNA疫苗的技术期望达成国际共识。这将促进全球mRNA疫苗生产和管理做法的国际融合，并向各国提供技术援助。世界卫生组织标准的提供还将有助于世界卫生组织对此类疫苗进行资格预审或《紧急使用清单》评估，特别是在当前COVID-19大流行的情况下。虽然世界卫生组织在确保疫苗质量、安全性和有效性方面有一些指导文件，但目前没有专门针对基于RNA平台的疫苗的指导文件。世界卫生组织欧洲经委会在其2020年8月和12月的会议上讨论了这些问题，并支持制定一份关于评价mRNA疫苗的监管考虑的文件，随着获得更多的科学和临床数据，可以对该文件进行更新。为紧急应对当前的COVID-19大流行，截至2020年12月底，一些mRNA疫苗已成为审查和监管部门批准紧急使用的对象。然而，需要进行正在进行的和未来的研究，以解决证据方面的未知因素和空白，而这些因素和空白对于为批准这些疫苗而完成数据至关重要。从批准紧急用途到发放许可证这一步骤，可能需要根据预期用途和证明疫苗质量、安全性和有效性的支持性数据进行若干额外的研究。世界卫生组织努力召集疫苗开发人员、制造商和监管机构专家进行国际讨论，审查现有科学证据，讨论关键问题，并就确保mRNA疫苗质量、安全性和有效性的科学和技术期望达成共识。在撰写本文时，世界卫生组织召集了一个由mRNA疫苗科学领域的专家和监管当局组成的起草小组，以制定一份文件草案，涵盖mRNA疫苗的生产和质量、非临床和临床问题。此外，该文件将阐述一些管制问题和挑战，以提供资料说明目前对这些疫苗评价的关键原则的管制思路。世界卫生组织将从2021年1月开始召开公众磋商以及与利益攸关方的磋商，以寻求对文件草案的严格审查并征求意见。最终文件将在科学证据和广泛共识的基础上制定，并考虑到利益攸关方的意见，将于2021年底提交欧洲经委会审议。最重要的是，强烈鼓励疫苗开发人员，特别是处于先进开发水平的开发人员，例如已进入2期和/或3期临床试验，从而可能证明疫苗的安全性和有效性的开发人员，在质量方面与公众分享候选mRNA疫苗的数据。安全和临床方面。各种全球或区域监管论坛已经可以在国家/机构之间讨论与产品质量、安全性和有效性相关的问题。与此同时，随着对目标病原体和mRNA平台了解的加深，技术也在不断进步(如优化生产、新技术)。在制定世界卫生组织mRNA疫苗指南时，这些都是需要考虑的重要因素。希望在不久的将来，将向公众提供更多关于mRNA疫苗质量、安全性和有效性的数据，利益攸关方将就确保质量、安全性和有效性的mRNA疫苗的技术规格达成国际共识。预计安全有效的mRNA疫苗将在突发公共卫生事件的传染病防治中发挥重要作用。建立全球对mRNA疫苗的信任需要认真审查这类疫苗特有的科学问题。这一举措将包括根据对疫苗在预防和控制疾病方面的作用的日益了解和理解，定期进行科学更新。世界卫生组织mRNA疫苗监管评估标准将为制定或更新国家对这些疫苗的评估监管要求提供依据。获得有质量、安全和有效性保证的疫苗是世界卫生组织的目标之一，这一目标适用于mRNA疫苗以及其他类型的疫苗。原文来源：Development of mRNA Vaccines: Scientific and Regulatory Issues.Vaccines (Basel).2021 Jan 23;9(2):81. |
