 导语 今天给同学们分享一篇关于鉴定脓毒症中的免疫反应和炎症相关的调节因子的生信文章“ LPIN1 Is a Regulatory Factor Associated With Immune Response and Inflammation in Sepsis ”，这篇文章于2022年2月发表在 Front Immunol 杂志上，影响因子=8.786。该研究旨在鉴定脓毒症中与铁死亡相关的基因，提供转化潜在的治疗靶点。总之，LPIN1可能成为非肿瘤脓毒症患者生存的可靠生物标志物，这与免疫和炎症状态有关。 1. 加权共表达网络（WGCNA）生信分析 根据脓毒症的临床特点，对健康对照组和脓毒症组的基因表达谱进行聚类生信分析（图1A）。为了确保网络是无标度的，作者选择软阈值为9（图 1B）。接下来，作者将表达式矩阵转换为邻接矩阵，然后将其转换为拓扑矩阵。平均连锁层次聚类方法用于聚类基因。作者还根据杂交动态剪切树的标准，将每个基因网络模块中的最小基因数设置为50个，用于确定基因模块，并计算出每个模块的特征基因值。共获得 21 个模块（图 1C）。与脓毒症相关性最高的模块是洋红色（图 1D，r = -0.65，P = 8e -99）。洋红色模块中的基因与脓毒症基因的显着性为cor = 0.79，P = 6.2e-182（图 1E）。  图1 WGCNA生信分析和模块分析 2. 目标LPIN1的差异表达分析与测定 将GSE65682分为正常对照组和非肿瘤脓毒症组后，用Limma包进行差异分析得到208个差异基因。其中低表达基因120个，高表达基因88个。结果通过热图（图 2A）和火山图（图 2B）可视化。  图2 差异分析 获得细胞测序数据后，作者将数据分为对照组、LPS刺激后2 h组（LPS2h）和LPS刺激后9 h组（LPS9h）。使用Limma包进行差异分析，在Ctrl-LPS2h组得到2167个DEG，其中低表达基因有1263个，高表达基因有904个（图2C，D），在Ctrl-LPS9h组得到4911个DEG，其中3902个是低表达基因，1017个高表达基因被表达（图 2D，E）。作者将GSE65682中的208个DEGs、LPS2h中的2167个DEGs、LPS2h中的4911个DEGs与848个品红色模块基因和470个铁死亡相关基因取交集获得PEBP1和LPIN1基因（图 2F）。然而LPIN1不在带有adj的DEG中。此外，作者使用GSE65682中非肿瘤脓毒症患者的生存数据，根据PEBP1和LPIN1的表达水平进行生存分析。作者发现PEBP1的P值为0.164（图 2G），LPIN1的P值为0.005（图 2H）。选择LPIN1进行后续生信分析。 3. LPIN1在脓毒症中的低表达 在GSE65682数据集中，提取正常组和脓毒症组的LPIN1表达水平，通过Wilcox检验检测两组之间的不同表达。脓毒症组LPIN1的表达低于正常组（图 3A）。在脓毒症细胞模型的测序数据中，LPIN1在LPS刺激后也随着时间的推移呈现下降趋势（图3B）。在GSE65682数据中，LPIN1的ROC曲线下的AUC可显着区分正常组和脓毒症组为0.975（图 3C）。LPIN1在全身的表达分布也不同，在肌肉组织中表达最高，其次是睾丸和神经，在血液和肺组织中表达中等（图3D）。  图3 LPIN1在脓毒症中的表达模式 4. LPIN1分组的差异分析和富集分析 GSE65682根据LPIN1的表达量中位值分为高表达组和低表达组，共获得了29个低表达基因和176个高表达基因，热图仅显示|logFC|中的前100个DEG（图 4A、B）。  图4 LPIN1分组的差异和富集分析 为了进一步研究不同LPIN1表达的功能效应，作者首先对GSE65682的205个DEGs进行GO和KEGG通路富集生信分析。BP、CC、MF和 KEGG 的前两组功能影响是淋巴细胞分化、T 细胞活化、T 细胞分化、免疫突触、质膜外侧等等（图 4C、D）。功能富集可以清楚地看出LPIN1的表达与T细胞和免疫密切相关。使用KEGG富集生信分析数据，Pathview包显示Th1和Th2细胞分化通路（图4E）、TCR信号通路（图4F）、Th17细胞分化通路（图4G）和核因子（NF）-κB信号通路（图 4H）都有显着的基因表达。 5. 基因集富集分析和基因集变异分析富集分析 为了避免仅使用交叉基因富集造成的片面性，作者还对GSE65682中非肿瘤脓毒症患者的所有基因进行了GSEA富集生信分析。八个相关数据集通过NF-κB、HallMark_Hypoxia、HallMark_cholesterol homeostasis、HallMark_DNA repair、HallMark_myogenesis、HallMark_interferon-γ response、HallMark_apical junction和HallMark_complement显示肿瘤坏死因子（TNF）α信号传导（图 5A、B）。这些通路也主要与炎症、氧化应激、免疫、糖酵解和其他类似作用有关。进行GSVA富集分析，LPIN1基因组存在显着差异。这些不同的基因组与WNT通路、线粒体代谢、激素作用和其他通路有关（图 5C、D）。  图5 GSEA和GSVA富集分析 6. PPI网络及相关功能网络构建 为了进一步探索其机制，作者使用Cytoscape构建了基于STRING在线数据库的PPI网络。结果表明188个基因有189个连接（图 6A），并且按分数筛选前20个关键基因，20个中心基因中有95个连接（图 6B）。为了探索这些hub基因的功能，应用了GO和KEGG富集生信分析。结果表明，它们的功能主要涉及免疫细胞激活和分化、免疫突触和原发性免疫缺陷（图6C）。为了探索TFs中hub基因的功能，作者使用NetworkAnalyst在线工具预测了20个hub基因的TFs并构建了mRNA-TF网络。在hub基因中，有六个hub基因具有形成网络的TF。该网络有49个节点和55个连接（图 6D）。由于hub基因可能发挥主导作用，作者还继续探索hub基因与小分子化合物之间的相互作用，为可能的治疗药物提供参考。作者使用 NetworkAnalyst在线工具预测来自20个中心基因的化合物并构建mRNA化学网络。其中，鉴定出形成网络的20个hub基因和168个小分子化合物，其中包括网络中的188个节点和358个连接（图6E）。  图6 PPI网络和相关功能网络分析 7. 免疫浸润分析 为了进一步确认LPIN1表达与免疫细胞的相关性，采用CIBERSORT生信分析免疫浸润比例，并绘制了非肿瘤脓毒症样本中22个免疫细胞的图谱（图7A）及其与22个免疫细胞的相关性（图 7B）。LPIN1与免疫浸润中免疫细胞的相关性生信分析表明，共有16种免疫细胞与LPIN1具有显着相关性。M0巨噬细胞、M1巨噬细胞、M2巨噬细胞、静息肥大细胞、中性粒细胞、静息自然杀伤（NK）细胞和T滤泡辅助细胞与LPIN1表达呈负相关。静息树突细胞、幼稚B细胞、单核细胞、肥大细胞活化、树突细胞活化、浆细胞、T细胞CD4记忆活化、NK细胞活化、T细胞CD8和LPIN1表达呈正相关（图7C）。作者进一步根据LPIN1的表达水平分析了免疫细胞评分的相关性，发现不同的免疫细胞在两组中表现不同。其中，活化的树突细胞、嗜酸性粒细胞、M0巨噬细胞、M1巨噬细胞、M2巨噬细胞、静息肥大细胞、单核细胞、中性粒细胞、活化NK细胞、静息NK细胞、浆细胞、幼稚T细胞CD4、T细胞CD8差异较大。（图 7D）。这些免疫浸润结果进一步支持了LPIN1的水平可能影响免疫浸润中免疫细胞的免疫活性。 8. 临床相关性分析 LPIN1与非肿瘤脓毒症患者的生存率存在显着相关性。作者使用 GSE65682中的临床数据来进一步分析其他临床因素对生存的影响。作者使用LPIN1单因素和多因素Cox回归分析包括年龄、性别、肺部感染是社区获得性还是医院获得性；多因素Cox分析显示LPIN1与生存率显着相关（图 8A）。为了探索临床因素对生存率的可预测性，根据多因素结果建立了列线图（图 8B），尤其是7天、14天和28天的生存率（图 8C-E）。C指数值为0.68，表明该列线图是可预测的，校准曲线也反映了这一点。  图8 临床相关性分析 9. LPIN1和相关通路变异 通过生信分析，作者发现脓毒症与炎症和免疫反应有关。为了证实这些发现，作者还发现LPS刺激可以抑制脓毒症大鼠模型中LPIN1的表达。NR8383和RLE细胞系（图 9A），在TNFα（图 9B）、Toll样受体（TLR）4（图 9C）、IKK（图 9D）、p65亚基（图 9E）和IκB（图 9F），与对照组进行比较。  图9 脓毒症中LPIN1表达及相关通路的验证 小结 总之，本研究通过生信分析和免疫浸润确定LPIN1与败血症死亡率有统计学关联。LPIN1的相关通路包括炎症和免疫反应，这表明LPIN1可能是脓毒症的潜在治疗靶点。对非肿瘤结合免疫浸润鉴定关键调节因子的生信思路感兴趣的老师，欢迎扫码咨询。 生信分析定制服务 请扫描下方二维码 |
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