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近年来，外泌体在研究、投资和产业化领域可以说是风风火火，层出不穷，2020年即将过去的一年，无论新冠肺炎治疗、肿瘤治疗诊断、皮肤创伤疾病、关节炎症、药物载体等均取得了许多重要进展。 由于研究的深入，从科研领域到投资领域热点不断，2020年10月19日专注于外泌体诊断企业思路迪完成高达15亿元人民币新一轮股权交易。早在2018年iPS细胞和外泌体疗法新贵BlueRock Therapeutics获得了史上最大的融资，由拜耳和Versant Future投资公司共同资助2.25亿美元开发iPS细胞外泌体治疗技术，用于治疗心脏病及神经退行性疾病。 趣话外泌体的前世今生和未来 那么， 外泌体究竟是何方神圣？ 外泌体是敌是友？我们该如何更好的利用外泌体呢？
敲黑板！敲黑板！来自美国德克萨斯大学MD安德森癌症中心RaghuKalluri研究组在Science杂志上发表了题为“The biology, function, and biomedicalapplications of exosomes”的综述。该综述对外泌体的生物生成和生物学特性，外泌体在生理条件和病理条件下发挥的作用以及外泌体在医学领域的应用几个方面进行了论述。
初识——外泌体 外泌体（exosomes）是一种能被机体内大多数细胞分泌的微小膜泡，具有脂质双层膜，直径大约为 30-150 nm。外泌体广泛存在并分布于各种体液中，携带和传递重要的信号分子，形成了一种全新的细胞-细胞间信息传递系统，影响细胞的生理状态并与多种疾病的发生与进程密切相关。 所有细胞包括真核生物和原核生物的细胞，不论在生理条件还是在病理条件下均可以释放细胞外囊泡（EVs），细胞外囊泡根据"身材"大小，大致可以分为两类:
（1）微泡（ectosomes，microvesicles,microparticles）：直径在50nm~1μm，通过细胞质膜向外出芽形成。 （2）外泌体（exosomes）：直径在40nm~160nm,平均直径为100nm，来源于内体（endosome）.细胞质膜内陷可以形成多泡体，多泡体与其他细胞内囊泡和细胞器融合，为外泌体的形成提供了不同类型的原料。 外泌体具有和细胞类似的拓扑结构，包含DNA，RNA，蛋白质，脂质和小分子代谢物等物质。关于外泌体产生的生物学意义和功能还存在很多未知的奥秘值得探索和研究。目前，关于外泌体的研究主要集中在外泌体的分离，功能的分类。功能的研究主要通过体外的组织培养，还难以达到一定分辨率的活体追踪和检测。 目前的主流观点认为，外泌体的产生过程为：细胞膜内陷，形成内体（endosome），再形成多泡体（multivesicular bodies，MVB），最后分泌到胞外成为外泌体。外泌体中携带有母细胞的多种蛋白质、脂类、DNA和RNA等重要信息。 外泌体最早见于1981年，EG Trams 等在体外培养的绵羊红细胞上清液中发现了有膜结构的小囊泡，并命名为 exosome。对于外泌体的作用，当时推测为细胞排泄废物的一种方式。 关于外泌体功能的推测： （1）清除细胞中多余的或不必要的物质，维持细胞内环境的稳态。 （2）细胞间通讯的信使。
外泌体前世之生物合成 外泌体的前世 1996年G Raposo 等发现类似于B 淋巴细胞的免疫细胞也会分泌抗原呈递外泌体（antigen presenting vesicle），所分泌的外泌体可以直接刺激效应CD4+ 细胞的抗肿瘤反应。2007 年H Valadi 等进一步发现细胞之间可以通过外泌体中RNA 交换遗传物质。随着有关外泌体研究越来越多，研究者发现它广泛参与了机体免疫应答、抗原呈递、细胞分化、肿瘤生长于侵袭等各种生物过程中。 外泌体的从头合成和内体成熟途径相关。细胞质膜内陷可以形成早期内体，早前存在的早期内体或者ER，Golgi出芽形成的囊泡与早期内体融合可以为早期内体提供内容物。早期内体（Rab5为标志物）通过酸化和物质交换成熟形成晚期内体(Rab7为标志物)。晚期内体最终可以形成多泡体（MVBs），多泡体内含有管腔内泡（ILVs），这些管腔内泡是通过多泡体膜向内凹陷出芽形成的。多泡体和溶酶体或自噬溶酶体融合发生物质降解，而和细胞质膜融合会导致管腔内泡分泌到细胞外，这些管腔内泡就是外泌体。由此可知，Rab，ESCRT（内吞体分选转运复合体）以及SNAREcomplex 等内体运输和分泌相关的蛋白会对外泌体的生成产生影响。
外泌体之异质性 从多泡体释放到细胞外的外泌体是一个高度异质性的群体，异质性体现在一下4个方面： （1） 尺寸的异质性 （2） 内容物的异质性 （3） 功能的异质性 （4） 来源的异质性
外泌体的内容物影响外泌体的大小，而细胞所处的微环境和细胞内发生的生物学过程则会影响外泌体中包含的内容物。外泌体含有丰富的跨膜蛋白，细胞黏附分子，支架蛋白，RNA结合蛋白，RNA，DNA，复杂聚糖等物质，但不同的外泌体中富集的物质不同。外泌体组成成分的差异尤其是细胞表面蛋白的差异会对受体细胞产生不同的影响，特异性的细胞表面标志物也为特定外泌体类群的纯化提供了可能。Escola等人发现tetraspanin (CD81,CD82,CD37, CD63) 在外泌体中高度富集，tetraspanin在相关膜蛋白的转运，稳定，寡聚化中发挥重要作用。表面含PD-L1和CD200的外泌体会抑制细胞的抗肿瘤应答，一些脂锚定蛋白包括Hedgehog形态素在发育和癌症进程中发挥重要作用。外泌体不同特征的互相组合极大地增加了外泌体类群的复杂性和异质性。
外泌体——亦敌亦友的细胞通讯特工
外泌体就像是细胞间通讯的特工，一群细胞分泌的外泌体在体液中游走，到达目的地后，可以作用于另一群细胞，引起受体细胞发生相应的应答。关于外泌体对受体细胞作用的认知多来自于对外泌体组分的去向和受体细胞发生的改变的相关研究。细胞吸收和分泌外泌体的过程彼此相联系，外泌体不同的吸收途径和机制以及对不同类型细胞作用的特异性增加了外泌体在细胞间通讯功能的复杂性。外泌体在发育，免疫应答，疾病发生等生物学过程中均发挥着重要作用。“祸兮福之所倚，福兮祸之所伏”，外泌体对机体的作用既有消极的一面也有积极的一面。 外泌体在生殖和发育中的作用 生殖，妊娠，胚胎发育等过程受到精准调控，这需要细胞彼此之间进行密切沟通。研究发现精液中的外泌体富含microRNAslet-7a, let-7b, miR-148a, miR-375, and miR-99a等microRNA，在精子的成熟中发挥重要作用。血液中外泌体的miRNA和蛋白质在孕期不同阶段会发生变化。乳汁中的外泌体可以传递miRNA，有助于增强新生儿的免疫力。 除了运输精子与卵子受精外,精浆(seminal plasma,SP)在生育过程中具有调节母胎免疫耐受、促进精卵结合、调控着床前胚胎发育及表观遗传等重要作用。外泌体(exosomes,Exos)为最新发现的细胞间通讯形式,可通过与靶细胞融合或传递其内载物参与许多生命活动。精液外泌体(seminal exosomes,SE)大量存在于SP中。研究表明,SE可广泛参与男性及女性生殖活动的调控,如精子完整性、精子获能、精子活力及母胎免疫等。 外泌体的免疫应答调节 外泌体装载着各种免疫相关分子，通过这些分子来调节免疫应答。例如，在细胞杀伤性T细胞或者自然杀伤性细胞来源的外泌体上，携带Fas配体、TRAIL、CD40配体等TNF家族蛋白，可诱导靶细胞凋亡。 有报道称，癌细胞中也可以释放装载着Fas配体或TRAIL等的外泌体，诱导免疫细胞凋亡，使癌细胞免受免疫细胞的攻击。一般情况下，TNF家族蛋白以膜结合形式产生，被膜型金属蛋白酶切割后转变为可溶性蛋白。膜结合蛋白主要担负诱导细胞凋亡的功能，但可溶性蛋白的活性较弱。 外泌体上的TNF家族蛋白不能被膜型金属蛋白酶切割，故较为稳定，同时借助膜形成三聚体，具有很强的诱导细胞凋亡的活性。而且，人们认为外泌体的转运TNF家族蛋白，与各种炎症疾病和自身免疫疾病的产生相关。 例如，从类风湿关节炎患者的滑膜成纤维细胞中释放出来的外泌体上，聚集高浓度的膜结合型TNF-α，会加重类风湿关节炎病情。也有报告指出，癌细胞来源的外泌体，除了能诱导免疫细胞凋亡外，还具有各种免疫抑制效果。 例如，当外泌体作用在自然杀伤细胞时，可抑制癌细胞识别机制中的NKG2D受体的表达，从而降低癌细胞的杀伤性。 另外，如果癌细胞来源的外泌体进入单核细胞，通过外泌体内所含的TGF-β或前列腺素E2等的作用，单核细胞会被诱导分化为髓源性免疫抑制细胞。 髓源性免疫抑制细胞释放出IL-10等各种免疫抑制分子，抑制免疫细胞活化或抑制T细胞的诱导，从而抑制抗肿瘤免疫。癌细胞通过利用抑制免疫细胞攻击自身这一机制，进而促进癌症的发展。
通过外泌体传递RNA 外泌体不仅含有蛋白质抗原，还含有分泌细胞来源的mRNA或non-coding RNA（特别是miRNA），其功能引起广泛关注。外泌体的脂质双分子层膜可保护这些RNA，不被RNase分解，在血液、体液中稳定存在。在外泌体及其分泌细胞中均可检测出RNA，也存在仅能在其中之一检测出RNA的情况，因此我们设想存在一种可以选择性将特定的RNA吸收至外泌体的机制。 进入靶细胞的外泌体与核内体膜融合，将其运载的RNA释放至靶细胞的细胞质中。释放出来的mRNA被翻译成蛋白质，而miRNA却抑制靶基因的翻译，因此表明外泌体可以调节靶细胞内的基因表达。 在免疫系统中，设想这个机制是遭遇外敌入侵的免疫细胞通过RNA向未遭遇入侵的细胞水平传递自身的活性状态，二者可以共同作为抵御外敌入侵的一种手段。 外泌体未来之化敌为友，大显身手 外泌体在细胞间的通讯可能发生在正常细胞和异常细胞之间，也可能发生在不同组织的细胞之间。研究表明，外泌体在免疫应答，病毒侵染，妊娠，心血管疾病，神经系统退行性疾病，癌症等进程中均发挥重要作用。 外泌体可作为疾病诊断的指标。 特别是近几年，外泌体在临床应用领域的发展潜力不断获得拓展，针对肿瘤、糖尿病、心脑血管疾病、神经退行性病变等重大疾病，以外泌体为基础的疾病诊断和药物的研发都取得了快速的进步。 外泌体（直径为30-100纳米）和微粒体（直径为100-1000纳米）是由大多数哺乳动物细胞分泌的小泡，并携带因子进行细胞间的通信。肿瘤可释放外泌体和微粒体携带特定蛋白质、mRNA、miRNA和DNA，这些肿瘤分泌囊泡，特别是外泌体，是无创诊断的潜在生物标志物。使用外泌体作为标记物大有希望克服当前仍然存在于癌症检测的技术挑战，如早期检测的难度，侵入性筛选，低特异性，和假阳性结果。然而，由于这些纳米级别分子成分多样的外泌体与其他细胞外膜泡的分离和成分分析较为繁琐，加之血液中还含有各种各样的细胞存在，因此，基于外泌体的诊断仍然具有很大的挑战。 近来，表面等离子体共振成像（SPRI）技术被用于肿瘤来源的外泌体的定量和标志物的检测，但是这种检测策略依赖于一种特定的仪器。 这种外泌体和微粒体的电化学表征和芯片方法的检测是基于金属纳米颗粒的直接电氧化反应，该反应特异性识别这些囊泡的表面标记。研究发现来源于前列腺癌细胞的外泌体和微粒体可以被表面蛋白上皮细胞黏附分子EpCAM和前列腺特异性膜抗原PSMA识别，表明外泌体和微粒体用作生物标记诊断前列腺癌和其他疾病具有很高的潜力。 外泌体可作为疾病治疗的载体。 越来越多的研究结果表明，外泌体作为细胞间信号转导的介质，参与了机体多种生理和病理过程[8]。此外，外泌体作为纳米载体还具有与细胞膜相似、体积小、荷负电、能避免吞噬、产生免疫逃逸、循环时间长、能穿透深层组织等优点。因此，外泌体可作为一种理想的天然纳米载体用于药物的递送。 外泌体或者外泌体组分进入受体细胞可以对受体细胞进行调控，改变外泌体组分或外泌体进入细胞的方式可以改变外泌体对受体细胞发挥的效应，因此可以利用外泌体干预疾病进程。外泌体进入细胞的方式包括受体介导的内吞，网格蛋白介导的内吞，脂筏包裹，吞噬作用，小凹和大胞饮。分离从树突细胞，成纤维细胞，间充质干细胞产生的外泌体，可以用于治疗，促进抗原递呈和对机体进行免疫调节。尽管外泌体本身会对疾病既有促进也有抑制作用，但可以通过对外泌体进行改造，可以利用外泌体包裹化学或生物学药物送到靶标细胞。由于外泌体可以穿透血脑屏障，因此在中枢神经系统相关疾病的药物递送中有广大的应用前景。
外泌体对关节软骨修复作用 骨关节炎（OA）是关节软骨退变引起的一种全身的、慢性关节疾病，是造成成人残疾的主要原因，其特点是关节软骨退变引起软骨破坏、关节间隙变窄、软骨下硬化。关节软骨损伤是OA的基本病理过程，促进软骨修复、恢复软骨完整性对缓解或逆转OA极其重要。关节软骨没有血供，由于缺乏足够的营养物质，软骨再生的能力较弱，在其损伤后很难自愈；而且软骨细胞是成人关节软骨中唯一的细胞类型，是终末分化细胞，细胞增殖能力有限，而且随着年龄的增长，这种能力会逐渐减弱。近年来，在OA的研究和再生医学方面，干细胞治疗取得了迅速的进展。胚胎干细胞（ESCs）和诱导多能干细胞（iPSCs）可以分化为软骨细胞。然而，ESCs或iPSCs的临床应用引起了人们对转基因序列的致瘤性、低效性等问题的关注。相比之下，间充质干细胞（MSCs）可以从骨髓和脂肪组织在内的各种成人组织中分离出来，为疾病的治疗提供丰富的干细胞。MSCs除了能分化成软骨细胞外，还能通过其旁分泌作用发挥免疫抑制和抗炎的作用。近年来有新的证据表明其旁分泌作用是由外泌体介导的 外泌体在皮肤损伤修复中的作用 干细胞外泌体与干细胞具有相似的生物学性能，但干细胞外泌体更加安全稳定高效，具有更强而复杂的信号分子转运和调控能力，为无细胞移植治疗的情况下实现组织再生、组织修复提供了新策略、新方法。 皮肤约占人体表面积的70%，是具有保护身体、排汗、感觉温度变化的最大器官，同时还参与机体免疫反应。常见的皮肤损伤包括创伤、烫伤、烧伤等，其中难愈性皮肤损伤和损伤后引起的严重瘢痕甚至会导致畸形，给患者带来极大的肉体和精神上的折磨。同时，外部环境刺激也会导致皮肤衰老损伤。 近年来，研究人员将外泌体与皮肤疾病联系起来，发现外泌体不仅参与皮肤生理、病理过程，如调节皮肤微环境中促炎细胞因子分泌，促进皮肤缺损处血管新生及胶原沉积，以及调节皮肤成纤维细胞增殖分化，同时还在皮肤微环境发生病变时发挥特异性信息传递作用。研究表明，间充质干细胞真正到达损伤部位并增殖分化为特定组织类型细胞仅是其修复损伤组织的冰山一角。间充质干细胞进行损伤修复的主要机制是旁分泌作用，即通过干细胞分泌外泌体进行损伤修复。间充质干细胞外泌体具有促进血管新生、抑制瘢痕形成的功能。这其中的调控机理又是什么呢？ 第一，间充质干细胞的外泌体能够显著促进创面的愈合。2015年发表的研究发现，间充质干细胞外泌体中含有有丰富的Wnt蛋白，它能活化β-catenin信号通路，同时通过激活Erk1/2信号通路正调控VEGFA、Cox-2、FGF2等（成血管基因）的表达，进而促进了二度烧伤大鼠模型深部创伤后血管的重生、胶原蛋白合成和皮肤损伤修复。 第二，间充质干细胞外泌体能够抑制缺损皮肤中肌成纤维细胞的过度聚集和瘢痕形成。肌成纤维细胞是在皮肤损伤修复中起组织收缩作用的细胞，但是，肌成纤维细胞持续存在会引起创伤面过度收缩，导致増生性瘢痕。2016年，科学研究发现外泌体中富含 microRNAs（microRNA-23a，microRNA-21等），其通过阻断TGF-β/SMAD2信号通路，抑制小鼠模型肌成纤维细胞的形成。 干细胞外泌体不仅在临床上用于烧伤、皮肤溃疡、创伤等受损皮肤的修复治疗，并且在改善肤质、修复衰老中毒皮肤等也有功效。此外，在心血管系统、外伤性脑损伤、肌肉骨骼系统、肝损伤、肾损伤等方面都展现出强大的修复再生和保护能力。干细胞外泌体能够激活多种信号通路，通过调节基因的表达，促进靶器官相关细胞活化、增殖，进而修复损伤，有望成为再生医学的一种新兴的修复工具，打破不可逆损伤这一修复障碍，使再生成为可能。 今天的分享就到这儿啦 外泌体即有趣又神秘 可她的面具正在缓缓揭开 露出迷人的面庞 参考文献： EG Trams, CJ Lauter, N Salem, et al. Exfoliation of membrane ecto-enzymes in the form of micro-vesicles [J]. Biochim Biophys Acta, 1981, 645: 63-70. G Raposo, HW Nijman, W Stoorvogel, et al. B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles [J]. J Exp Med, 1996, 183(3): 1161. Valadi H, Ekström K, Bossios A, et al. Exosome-mediatedtransferofmRNAsandmicroRNAsisanovelmechanismofgeneticexchangebetweencells [J]. Nat Cell Biol, 2007, 9(6): 654-659. Ibrahim A, Marbán E. Exosomes: Fundamental Biology and Roles in Cardiovascular Physiology [J]. Annual Review of Physiology, 2016, 78(1): 67-83. Bang C, Batkai S, Dangwal S, et al. Cardiac fibroblast-derived microRNA passenger strand-enriched exosomes mediate cardiomyocyte hypertrophy [J]. Journal of Clinical Investigation, 2014, 124(5):2136-46. |
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