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色谱纯化的异二聚体，由 66kDa 和 51kDa 亚基组成。以 10mM 磷酸钾、pH 7.4、1mM DTT 和 20% 甘油溶液的形式提供。主要用于艾滋病研究目的；该酶在其他应用中的保真度低于 AMV 酶，例如从 mRNA 制备 cDNA 用于克隆目的。 Worthington 逆转录酶、重组 HIV化学性质： 单位定义：一个单位在 37°C、pH 8.3 条件下，使用 poly(A)/oligo(dT)12-18 作为模板/引物在 20 分钟内将 1 nmole 氚化 d-TMP 加入酸可沉淀产品中。 注意：目前的检测使用更有效的模板/引物组合，与我们之前的检测相比，比活性增加了大约两倍。因此，Worthington 的包装尺寸包含相同数量的蛋白质，其活性是新测定的两倍。 Worthington 逆转录酶、重组 HIV测定： 单元定义：一个单元将 1 纳摩尔氚化 dTMP 加入酸不溶性产物中，使用 poly(A)·oligo(dT) 12-18作为模板引物，在 37°C 下 20 分钟。 试剂： 0.05 M Tris，pH 8.3，含有 0.008 M MgCl 2 1 mg/ml 多聚腺苷酸水溶液（聚 A） DNA引物：寡核苷酸d(T) 12-18 1 μ 摩尔 dTTP/mL 储备溶液 [甲基- 3 H]-胸苷 5'-三磷酸 ( 3 H-dTTP) dTTP- 3 H-dTTP 工作混合物：每毫升 100 nmol/mL dTTP 添加 1-2 μL 3 H-dTTP，以获得 1 至 1.5 x 10 5 cpm/mL 1% 牛血清白蛋白 10% 高氯酸 1% 高氯酸 缓冲底物反应混合物：新鲜制备，临用前： 每 1mL 反应混合物所需混合物： 0.7 mL Tris/HCl，pH 8.3，0.008M MgCl 2 0.3 mL 1 mg/mL poly(A) RNA 模板 0.005 mL 0.02 mg /mL oligo d(T) 12-18 DNA 引物 0.02mL 1% BSA 酶： 根据需要用 0.05M Tris/HCl，pH 8.3，0.008M MgCl 2稀释，含有 0.1 mg/mL (1%) BSA 程序： 如下移液器到每个管中： 缓冲底物混合物 0.1 毫升 dTTP- 3 H 3 -dTTP 0.1 毫升 酶 5-10 微升 在 37°C 下孵育 20 分钟。加入 1 ml 10% 冷高氯酸终止反应。通过与 Millipore 真空歧管一起使用的 0.2μ 歧管过滤器进行过滤。使用 2mL 1% 冷高氯酸/洗涤液洗涤四次。将过滤器转移到闪烁瓶中。加入 2mL Cellosolve（或 2-甲氧基乙醇）溶解过滤器。添加 Cellosolve 后过滤器变得不透明。确保过滤器在继续之前溶解。加入 10mL 闪烁鸡尾酒并计数。 Worthington 逆转录酶、重组 HIV相关文献： 1.Abbotts, J., and Wilson, S.: Inhibitors of HIV-1 Reverse Transcriptase and Fidelity of in vitro DNA Replication , J Enzym Inhib 6, 35, 1992 2.Abbotts, J., Jaju, M., and Wilson, S.: Thermodynamics of A:G Mismatch Poly(dG) Synthesis by Human Immunodeficiency Virus 1 Reverse Transcriptase , J Biol Chem 266, 3937, 1991 3.Austermann, S., Kruhoffer, M., and Grosse, F.: Inhibition of Human Immunodeficiency Virus Type-1 Reverse Transcriptase by 3'-Blocked Oligonucleotide Primers , Biochem Pharmacol 43, 2581, 1992 |
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