【原】【分子克隆】什么是IRES元件和2A肽(P2A/T2A/E2A/F2A)？

GCTA 2022-08-12 发布于广东

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什么是IRES元件？

IRES元件是一段非编码RNA，又被称为内部核糖体进入位点序列（Internal ribosome entry site），能招募核糖体对mRNA进行翻译。

实验证明，将IRES与外源cDNA融合，发现IRES能独立地起始翻译。(IRES可以直接连接ATG起始密码子)。

一般情况下，真核mRNA的翻译都需要5'帽子来介导核糖体结合，Eif4e首先结合到5'帽子结构，然后形成翻译起始复合物启动蛋白质翻译，但真核生物和病毒中还存在一些例外情况，例如一些基因5'端具有一段较短的RNA序列（约150-250BP），这类RNA序列能折叠成类似于起始tRNA的结构，从而介导核糖体与RNA结合，起始蛋白质翻译。

核糖体活性结合位点与mRNA翻译过程

翻译起始复合物（translation initiation complex）：由核糖体亚基，一个mRNA模板，一个起始的tRNA分子和起始因子组成并组装在蛋白质合成起始点的复合物。

最常用的IRES元件来源于脑心肌炎病毒（EMCV），作为额外的核糖体募集位点起作用，允许翻译起始发生在除了翻译起始位点之外的mRNA内部区域。使用单个启动子驱动多个ORF的表达时，可以选择将多个ORF置于启动子后面，通过连接子（linkers）如内部核糖体进入位点（IRES）或2A肽将每个ORF分隔开，单个mRNA转录物将会产生多个蛋白。

IRES元件序列：cccctctccctcccccccccctaacgttactggccgaagccgcttggaataaggccggtgtgcgtttgtctatatgttattttccaccatattgccgtcttttggcaatgtgagggcccggaaacctggccctgtcttcttgacgagcattcctaggggtctttcccctctcgccaaaggaatgcaaggtctgttgaatgtcgtgaaggaagcagttcctctggaagcttcttgaagacaaacaacgtctgtagcgaccctttgcaggcagcggaaccccccacctggcgacaggtgcctctgcggccaaaagccacgtgtataagatacacctgcaaaggcggcacaaccccagtgccacgttgtgagttggatagttgtggaaagagtcaaatggctctcctcaagcgtattcaacaaggggctgaaggatgcccagaaggtaccccattgtatgggatctgatctggggcctcggtgcacatgctttacatgtgtttagtcgaggttaaaaaaacgtctaggccccccgaaccacggggacgtggttttcctttgaaaaacacgatgataA

提问：Intron最后的命运会怎样?会被转运出核吗？何时何地被降解？

什么是2A肽？

2A肽是来源于病毒的短肽（一般为18~25个氨基酸），通常被称为“自我剪切”肽。

2A肽能使一条转录产物产生多种蛋白。

2A肽并不是完全的“自我剪切”，而是通过使核糖体跳过2A元件C-末端的甘氨酸和脯氨酸肽键的合成而发挥作用，最终导致2A序列末端和下游产物分离。

“Eukaryotic ribosomes fail to insert a peptide bond between the Gly and Pro residues, yielding separate polypeptides.”

其中，上游蛋白的C端将会添加一些额外的2A残基，而下游蛋白的N端将会有额外的脯氨酸。

目前有四种常用的2A肽，分别是P2A，T2A，E2A和F2A，来源于四种不同的病毒。

P2A肽的核酸序列可以根据需求来改变，但是其蛋白质序列一般是固定的。其中一个例子如下：

P2A肽序列：gcaacaaacttctctctgctgaaacaagccggagatgtcgaagagaatcctggaccg

两种连接子（linkers）的优缺点比较

和2A肽相比，IRES的好处在于它不影响上下游ORF的蛋白序列，可以独立启动翻译。

IRES的缺点是下游ORF的表达水平比较低（为上游ORF表达水平的10%-20%）。因为核糖体从内部插入的效率不如翻译起始复合物组装的效率，所以在IRES后表达荧光蛋白（EGFP）时，难以获得可检测的荧光信号，这就导致IRES难以在体内应用。此外，IRES元件的大小（>500 bp）也可能会增加载体构建和病毒包装的难度。

2A肽下游ORF的表达水平与上游ORF相当，这是IRES元件所不能比拟的。

但是，2A肽的缺点是它可能会在上下游ORF留下附加残基，从而产生潜在的不良影响。但是对于比较大的蛋白质来说其影响可以忽略不计，很多研究都会在过表达的蛋白质的N端或者C端加入一个甚至三个Flag序列（gactacaaggacgacgatgacaag）。

如果不需要第二个ORF的高水平表达（如药物筛选标记），那么IRES应该是可以满足实验要求的。

然而，如果多顺反子中存在两个以上的ORF，或者等量共表达多个ORF很重要，这时就需要使用2A肽。

在四种常用的2A肽（P2A，T2A，E2A和F2A）中，P2A通常具有最高的切割效率（接近100％），接下来是T2A，其次是E2A和F2A。F2A的切割效率仅为约50％。

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温馨提示:

2A肽的自我切割并不是100％有效的，其效率会受上下游ORF序列的影响。因此，不能进行有效自我切割的融合蛋白将会是一种翻译产物，在某些实验运用中，这是一个值得注意的问题。我们在构建载体的时候，特别需要注意的是IRES前一个ORF有终止密码子，2A肽前一个ORF的终止密码子需要删除。