Cell | 复制压力——破坏人类胚胎染色体分离和着床前发育的“罪魁祸首”

影响人类繁殖效率一个主要原因就是染色体异常导致的发育失败。在人类胚胎发育进入卵裂期以后，经常会在有丝分裂的过程出现染色体异常并引入非整倍体染色体，但其发生机理尚不清楚。而人类胚胎发育过程中有丝分裂的进程与形成的胚胎质量密切相关，并且卵裂和囊胚期胚胎的质量在决定和评估胚胎移植方面具有预后价值和指导意义。因此，开展人类胚胎发育中染色体分裂异常的形成和修复机制的实验研究至关重要。

近日，美国哥伦比亚大学的Dieter Egli课题组在Cell发表了题为Replication stress impairs chromosome segregation and preimplantation development in human embryos的研究论文。他们发现胚胎发育在进入第一个细胞周期时会出现S期复制叉停止、复制叉速率低和DNA合成持续到G2期的现象。DNA损伤foci分布的位置与G2期依赖于ATR和mre11的方式形成的塌陷的复制叉、双链断裂（DSB）和不完全复制的位点都是一致的，随后会伴随着染色体断裂和分裂非整倍体的发生。当不完全的复制进入有丝分裂后，会导致染色体断裂、整个或节段染色体错误、微核、染色体碎裂和胚胎质量差的发生。并且自发染色体断裂的位点与G2期的DNA合成位点也是一致的，都是位于基因贫乏区。因此，哺乳动物的着床前早期胚胎中DNA复制压力更容易使基因贫乏的区域变得脆弱，进而形成非整倍体，最终损害发育潜力。

近期的研究发现Cas9引入的DSB会导致整个染色体和节段染色体的非整倍体。并且节段性染色体非整倍体中的DSBs也可能会自发性产生并导致非整倍性。GADD 45 基因位于人染色体1p31.1-21.2上，在不同类型的恶性肿瘤中， GADD 45家族基因存在发生序列改变或呈基因易突变的特征。该家族基因是在响应各种形式的DNA损伤时诱导的表达的，并且能够介导细胞周期阻滞在G2期。已有的研究表明体外受精(IVF)过程中产生的非整倍体人类胚胎阻滞，可上调由于生长停滞和DNA损伤引发的45(GADD45)家族基因的表达。因此，人类胚胎中自发的DNA损伤会影响细胞周期进程，并导致胚胎损耗。

已有的研究表明，有丝分裂细胞周期进程、倍性、形成的囊胚质量和成功植入之间有很强的相关性。世界各地的体外受精诊所根据反映细胞周期进展的形态标准对卵裂和囊胚期胚胎的质量进行分级。而这些标准在决定是否进行胚胎移植方面具有预后价值和指导意义。有趣的是，具有节段非整倍体的胚胎比无整倍体的胚胎质量低。然而，自发性染色体断裂是如何形成以及在人类胚胎中是如何修复的截止目前为止还没有实验研究。此外，在基因组中自发断裂的位置与它们在基因组中的坐标对应关系还没有探究，这将会影响我们对其形成机制的理解。

在本研究中，作者首先通过免疫荧光实验分别对第0天（受精和原核形成后不久）和第一天（第一次有丝分裂前）的受精卵以及受精卵形成后的第1、3、5天进行γH2AX、RAD51、RPA32和53BP1等染色，并对形成的不同蛋白标记的foci进行统计分析后发现DNA损伤是在第一个细胞周期中获得的，随后一直存在于卵裂期。进一步的研究表明ssDNA、微核、染色体桥、Rad51 foci、53BP1 foci和53BP1小体的形成以及H2AX、RPA32和CHK1在着床前发育中的磷酸化都与DNA复制压力、DSBs以及断裂与ssDNA间隙的组合是一致的，在有丝分裂进入时表现为复制不完全或者复制较晚。这些研究都证实了人类胚胎中的自发性DNA损伤发生在第一个细胞周期。

接下来，作者通过进一步的机制研究发现DNA损伤主要发生在人类受精卵第一个细胞周期的G2期，并且CHK1能够延迟有丝分裂进入，以响应G2期未完成复制的DNA。在小鼠和人类胚胎发育中，不对称的姐妹分叉进程、低的复制分叉速度和DNA在G2期的复制都出现在第一个细胞周期中。并且在人类卵裂期胚胎中，自发性dsb导致了染色体的节段丢失。然后，作者通过鉴定拷贝数转换区域，发现胚胎发育的第三天，染色体自发断裂的位置主要定位于基因贫瘠区和着丝粒上。进一步研究发现微核构成有丝分裂的非整倍体并且染色体易碎性与胚胎基因组激活无关。此外，G2复制位点处的基因贫瘠，并且与自发染色体断裂位点一致。并且人类受精卵G2期的DNA合成与转录-复制并无冲突。而第一次有丝分裂时的不完全复制破坏了随后细胞分裂和表型的基因组，也是人类胚胎常见的自发缺陷。最后，作者通过研究比较小鼠和人类胚胎对未复制DNA的反应不同，发现小鼠胚胎自发性染色体分离错误和干扰G2期复制完成引发的染色体分离错误等都明显低于人类。DNA损伤灶的低效形成、未复制DNA的有丝分裂前期的进展、不完全复制位点染色体断裂的频繁形成，以及卵裂分裂期间不稳定基因组的形成决定了人类和小鼠植入前发育的差异。

总的来说，本研究证实了在人类胚胎植入前，DNA 在G2期复制导致染色体断裂、节段性非整倍体和较差的胚胎质量，揭示了胚胎发育过程中非整倍染色体发生的机理。发现了复制压力是破坏人类胚胎染色体分离和着床前发育的关键因素，为胚胎移植的预后等提供了实验证据。